新型鴨呼腸孤病毒山東株的分離鑒定及致病性分析

馬 芹 ， 許明清 ， 汪建華 ， 趙 杰 ， 張中波 ， 石艷紅 ， 李玉峰 ， 張秀美

(1. 山東和康源生物育種股份有限公司 ， 山東 濟南 250102 ； 2.山東省農業科學院家禽研究所 ， 山東 濟南 250031 ；3. 山東省農業科學院畜牧獸醫研究所 ， 山東 濟南 250100)

新型鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)感染最早發生在我國南方地區，北方較少報道[1-3]，自2015年開始，北方櫻桃谷鴨的NDRV檢出率明顯增高[4-5]。近2年，NDRV在山東地區的櫻桃谷鴨中廣泛流行，主要引起雛鴨精神沉郁、食欲廢絕，消瘦，跗關節腫脹、腿軟等一些特征性的癥狀[6-8]，料肉比明顯升高，剖檢可見脾臟出血、壞死，機體免疫力下降，進而繼發感染導致較高的死亡率[9]；同時關節腫脹、瘸腿現象較為嚴重，造成了較高的淘汰率，給養殖帶來了巨大困擾。近日，山東菏澤櫻桃谷部分鴨出現脾臟壞死、瘸腿癥狀，本課題組通過對8個鴨養殖區進行調研，了解到腿病主要發生于6～8周齡的雛鴨，并且發病鴨大多表現脾臟異常，據此初步懷疑與新型鴨呼腸孤病毒有關。本試驗從病死鴨中采集肝臟、脾臟，進行病原的分離鑒定、純化培養及致病性分析，探究新型鴨呼腸孤病毒是否為引發脾臟壞死、瘸腿癥狀的原因，以期為該病的綜合防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料 山東菏澤地區商品肉鴨養殖場10日齡發病鴨。

1.2 試驗用雞胚、動物、細胞 7日齡SPF雞胚，購自山東斯帕法斯公司；1日齡商品鴨、35周齡健康櫻桃谷種鴨，均購自山東和康源生物育種股份有限公司；Vero細胞由本實驗室提供。

1.3 主要儀器與試劑 PCR儀，購自伯樂生命醫學產品有限公司；凝膠成像系統，購自北京賽智創業科技有限公司。RNA提取試劑盒，購自愛思進生物技術有限公司；RT-PCR反應試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 病料處理 無菌采集發病鴨的肝臟和脾臟，剪碎后按1∶3比例加入無菌PBS溶液，充分研磨制備組織懸液，反復凍融3次后8 000 r/min離心10 min，取上清液用于病毒核酸的提取，具體提取步驟參考試劑盒內說明書。

1.4.2 病原鑒定 根據GenBank 中登錄的新型鴨呼腸孤病毒S1基因序列，利用Primer 5軟件設計特異性鑒定引物，上游引物為5′-ACCTCAGGATATCGCTGAAACT-3′,下游引物為5′-CTCCATCCCTGCAGCACATGTAAAG-3′。RT-PCR擴增體系：2×Mix 12.5 μL，One-step Mix 1.25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，病毒RNA 2 μL，ddH2O 7.25 μL。擴增程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 20 s，72 ℃ 8 min，擴增結束后在凝膠成像系統下進行觀察，膠回收后連接轉化并進行測序分析。

1.4.3 病毒的分離培養 將1.4.1制備的組織懸液經0.22 μm濾器過濾后，接種于7日齡SPF雞胚尿囊腔，接種量為0.2 mL/只，胚體放置于37 ℃溫箱內培養，每天觀察胚體情況，棄去24 h內死亡雞胚，收取24～144 h內死亡雞胚的尿囊液及胚體，研磨后進行無菌試驗驗證和新型鴨呼腸孤病毒檢測，同時檢測是否具有鴨瘟病毒、坦布蘇病毒、副黏病毒、鴨肝炎病毒、細小病毒等混合感染。分離毒在雞胚傳代穩定后，將收取的病毒液接種于Vero細胞，觀察該病毒對Vero細胞的適應性。

1.4.4 動物回歸試驗 為探究該病毒對雛鴨的致病性，將80只1日齡櫻桃谷鴨平均分成2個組，攻毒組頸部皮下注射病毒液0.5 mL/只(105.0ELD50/0.1 mL)，對照組頸部皮下注射同等劑量無菌PBS溶液，每天觀察鴨只精神狀態和死亡情況。于攻毒前和攻毒后第10天分別進行稱重，比較體重變化情況；同時于攻毒后第5、7天和第10天進行剖檢，每次每組剖檢10只，觀察臟器變化情況；剩余鴨只繼續飼養至8周，觀察腿病發生情況。

2 結果

2.1 病原鑒定 通過PCR擴增得到1 300 bp的特異性條帶(圖1)，與新型鴨呼腸孤病毒S1基因擴增片段大小相符。經測序和同源性分析，可知分離病毒株與新型鴨呼腸孤病毒代表毒株(TH11、091等代表毒株)同源性為94%～96%，與北京鴨呼腸孤病毒[4](KT861593)同源性為96.8%，與鵝呼腸孤病毒(Goose orthoreovirus，GRV)同源性為95%，與番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)同源性為49%～50%，與禽呼腸孤病毒(Avian orthoreovirus，ARV)同源性為44%～48%，利用MEGA軟件建立進化樹分析可知，分離病毒株與新型呼腸孤病毒和鵝源呼腸孤病毒親緣關系較近，與MDRV、ARV處于不同分支(圖2)，因此確定該分離病毒株為新型鴨呼腸孤病毒，毒株命名為HZDRV。

圖1 S1基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of S1 geneM：Marker； 1：陰性對照； 2：陽性對照； 3：肝臟； 4：脾臟M:Marker; 1:Negative control; 2:Positive control; 3:Liver; 4:Spleen

圖2 不同毒株S1基因序列的同源性分析Fig.2 Homology analysis of S1 gene sequences from different strains▲：本試驗分離株▲:The strain isolated in this experiment

2.2 病毒的分離培養 組織懸液接種7日齡SPF雞胚后，可導致胚體在72～96 h內集中死亡，胚體呈現水腫、嚴重出血(圖3)。收取尿囊液和胚體進行RT-PCR擴增，結果顯示，新型鴨呼腸孤病毒擴增陽性，鴨瘟病毒、坦布蘇病毒、副黏病毒、鴨肝炎病毒、細小病毒擴增陰性(圖4)，細菌檢測陰性。病毒液接種Vero細胞后，細胞圓縮脫落，傳至第5代時，觀察到細胞拉網空泡化(圖5)，因此該病毒在雞胚和Vero細胞上均可增殖。

圖3 NDRV分離毒株感染雞胚病變Fig.3 Lesion of chick embryo infected with NDRV isolate 1：正常胚體； 2～3：死胚胚體1:Normal embryo body; 2-3:Dead embryo body

圖4 RT-PCR檢測結果Fig.4 RT-PCR detection resultM：Marker； 1：陽性對照； 2：陰性對照； 3：新型鴨呼腸孤病毒；4：細小病毒； 5：鴨肝炎病毒； 6：副黏病毒；7：坦布蘇病毒； 8：鴨瘟病毒M:Marker; 1:Positive control; 2:Negative control; 3:Novel duck reovirus; 4:Parvovirus; 5:Duck hepatitis virus; 6:Paramyxovirus; 7:Tambus virus; 8:Duck plague virus

2.3 動物回歸試驗 雛鴨致病性試驗結果顯示：1日齡雛鴨攻毒后第5天死亡1只，剖檢可見脾臟壞死，但尚未形成炎性膜；攻毒后第7天未出現雛鴨死亡，但剖檢時可見壞死灶和炎性膜。攻毒后第10天仍未出現雛鴨死亡，但剖檢發現脾臟壞死比例為10/10，對照組為0/10。稱重結果顯示，攻毒組平均體重為390 g，對照組平均體重為538 g，攻毒組體重明顯低于對照組，兩組相差38%。觀察至第8周，攻毒組有5只出現瘸腿，瘸腿比例5/10，跗關節無明顯變化，剖檢可見膝關節及附近的肌肉有大量干酪樣物、部分鴨股骨頭壞死，結果見圖6；對照組無腿病發生。

圖5 病毒在Vero細胞上增殖Fig.5 Virus multiplication in Vero cellsA：對照； B：24 h； C：40 h； D:48 hA:Control; B:24 h; C:40 h; D:48 h

3 討論

本試驗從發生脾臟壞死的病死鴨中分離出病毒株，并用RT-PCR擴增、測序分析確認為新型鴨呼腸孤病毒，隨后將分離到的病毒株接種于1日齡櫻桃谷雛鴨，通過剖檢觀察到脾臟壞死、變硬，還觀察到肝臟有壞死灶，證明新型鴨呼腸孤病毒可導致雛鴨的脾臟和肝臟壞死。據劉偉等[2]報道，感染鴨還可觀察到心肌出血、腎臟和法氏囊出血，但在本試驗中未觀察到相應癥狀，可能是不同分離毒株在致病機理方面有所差異。攻毒鴨觀察至第8周，50%左右的鴨出現瘸腿癥狀，主要剖檢癥狀為肌腱肌肉處有大量黏液或干酪樣物，與養殖現場第6～8周出現的腿病癥狀吻合，通過實驗室的分離鑒定，在肌腱中分離到NDRV。鴨發生瘸腿的因素有很多，如鴨呼腸孤病毒、葡萄球菌、鴨沙門菌、鏈球菌感染及外傷等。葡萄球菌感染多發生在中鴨和成鴨，引起跗關節和趾關節腫脹變形，剖檢觀察到關節腔內有白色或淡黃色膿性分泌物或干酪樣物，肌腱也腫脹變形。籠舍的金屬尖銳處或地面的突出粗糙會造成鴨的外部傷口，若飼養環境處理不當，會繼而引發細菌感染，嚴重者會引起瘸腿。所以對于腿部疾病病例，需要臨床和實驗室診斷技術相結合的方式進行鑒別診斷。目前，我國尚未研發出新型鴨呼腸孤病毒疫苗，根據現場情況，疫苗研制更加迫切，特別是活疫苗的研制和開發[10-11]，會給前期腿病防控帶來新曙光。雛鴨脾臟壞死的防控可側重母源抗體的保護，目前母源抗體或卵黃抗體對雛鴨的保護尚不明確，需要進一步研究。