圈養喜馬拉雅塔爾羊糞便菌群結構及大腸桿菌耐藥性試驗

劉 青 ， 朱云蕓 ， 張成林 ， 李 偉 ， 仉 偉 ， 謝緒昌

(1. 濟南市公園發展服務中心動物園 ， 山東 濟南 250031 ； 2. 北京動物園 ， 北京 西城 100044)

喜馬拉雅塔爾羊(Hemitragusjemlahicus)別名塔爾羊，屬于牛科，以草本植物為主食，體型健壯善于攀爬，常結群活動，我國于1974年上半年在西藏自治區波曲河谷的曲象地區首次發現[1]。塔爾羊數量稀少、分布狹窄，現已列為國家一級保護動物。濟南動物園現有的塔爾羊種群是國內唯一的人工飼養種群。

腸道微生物是指動物腸道內全部的、復雜的、動態變化的微生物群落，正常情況下各類微生物在腸道內保持共生或拮抗關系，共同形成一個動態平衡的微生態系統。與非反芻動物相比，反芻動物的腸道微生物群在物種生物學中扮演著更重要的角色[2]。大多數哺乳動物消化道菌群集中在后腸，主要是結腸，在進行糞便菌群和結腸內容物菌群結構的比較時發現，糞便菌群基本上可以代表腸道內容物菌群[3]，因此對人類和野生動物的研究多以糞便菌群來代表腸道內容物菌群。本試驗以塔爾羊糞便作為樣本，對同一時期成年和亞成體健康塔爾羊腸道糞便菌群的組成和結構進行分析比較，試驗結果可為該種屬動物疾病診斷和治療提供依據。此外，本試驗還以塔爾羊糞便中分離出的大腸桿菌作為指示菌，進行種群耐藥性監測，掌握群體耐藥流行情況，結果為臨床治療用藥提供科學參考和指導，從而延緩細菌耐藥性的產生和發展。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 2019年12月份采集濟南動物園成年和亞成體健康塔爾羊新鮮糞便樣本各6份，放入無菌袋，置于干冰內保存送檢。另用無菌棉簽采集20份不同個體新鮮糞便放入含500 μL無菌PBS的1.5 mL離心管中，低溫保存送回實驗室立即處理。

1.2 高通量測序 將糞便樣本送至生工生物工程(上海)股份有限公司，提取塔爾羊糞便基因組DNA，PCR擴增16S rRNA基因的V3+V4區域，測序后的數據經拼接、過濾和去嵌合體處理后得到有效數據，在97%的相似度水平下進行OUT聚類和物種分類學統計，并在門、目和屬水平上進行細菌組成和豐度對比分析，根據Alpha多樣性指數(ACE、Chao、Shannon和Simpson)進行組間差異性分析。

1.3 大腸桿菌的分離鑒定 將含有糞樣的PBS加入內含2 mL滅菌營養肉湯的試管中，37 ℃培養擴增，取適宜濃度菌液涂布到大腸桿菌顯色培養基中，37 ℃培養18～24 h，挑取藍綠色菌落進行純化培養。提取純化后的細菌DNA，利用細菌16S rRNA基因通用引物(F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，R：GGTTACCTTGTTACGACTT)進行PCR擴增，陽性產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4 耐藥性檢測 根據美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法，對分離的大腸桿菌進行抗菌藥物最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)檢測，陽性對照為大腸桿菌ATCC 25922菌株，結果判定參照CLSI標準以敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)3種形式記錄。

1.5 統計分析 采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，使用方差分析法進行差異顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著，P≥0.05表示差異不顯著，結果以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 樣本序列與OUT聚類 12份樣本共獲得1 589 702條有效序列，成年組平均122 323條，亞成體組平均142 626條。通過對測序數據按97%的相似水平進行聚類分析，成年組平均每個樣本獲得4 589個OTU，亞成體組平均獲得4 683個OTU。

2.2 糞便菌群組成分析 本試驗中檢測到的糞便菌共包含18個門、32個綱、41個目、77個科和168個屬，見表1。

表1 塔爾羊在不同分類學水平上的菌群組成個數Table 1 The number of flora composition in different taxonomic levels of captive tahr

2.2.1 門分類水平上的細菌組成 在門水平上，厚壁菌和擬桿菌為兩大優勢菌門。成年組和亞成體組厚壁菌門的平均含量分別為(60.35±1.71)%和(59.96±2.48)%；擬桿菌門的平均含量分別為(29.95±2.80)%和(29.60±2.51)%。豐度大于1%的還有疣微菌門、放線菌門和變形菌門，成年組的含量分別為(3.36±2.80)%、(1.76±0.24)%和(1.30±0.09)%；亞成體組的含量分別為(4.27±1.68)%、(1.69±0.29)%和(1.23±0.31)%。對豐度平均含量前10位的細菌組成進行組間統計學檢驗，差異不顯著(P>0.05)，見圖1。

圖1 在門水平上的菌群組成Fig.1 Flora composition at the phylum level

2.2.2 目分類水平上的細菌組成 目分類水平上以梭菌目和擬桿菌目為主，其次為疣微菌目、黃桿菌目、Coriobacteriales和丹毒絲菌目。成年組這6種細菌含量分別為(56.69±1.57)%、(25.49±1.69)%、(2.75±0.91)%、(2.16±1.41)%、(1.30±0.19)%和(1.04±0.12)%；亞成體組分別為(56.44±1.95)%、(26.55±3.00)%、(3.75±1.71)%、(1.11±0.82)%、(1.32±0.27)%和(1.11±0.33)%，經組間統計學檢驗，差異不顯著(P>0.05)。

2.2.3 屬分類水平上的細菌組成 在屬水平上，去除未分類的菌屬，成年組排名前5位的菌屬分別為擬桿菌屬(7.52±0.77)%、孢桿菌屬(3.63±1.72)%、梭菌IV(3.32±0.21)%、艾克曼菌屬(2.75±0.91)%和普雷沃氏菌屬(2.50±0.45)%；亞成體列前5位的菌屬分別為擬桿菌屬(7.61±1.02)%、艾克曼菌屬(3.75±1.71)%、普雷沃氏菌屬(3.37±1.41)%、梭菌IV(3.24±0.18)%和顫桿菌克屬(2.87±1.53)%。對平均豐度1%的菌屬進行組間統計學檢驗，孢桿菌屬含量成年組顯著高于亞成體組(P<0.05)，其他菌屬含量差異不顯著(P>0.05)，見圖2。

圖2 在屬水平上的菌群組成Fig.2 Flora composition at the genus level

2.3 Alpha多樣性指數分析 所有樣本覆蓋率指數大于0.99，表明測序深度已基本覆蓋樣品中所有物種。成年組的Shannon、Ace、Chao1和Simpson指數均高于亞成體組，統計學檢驗兩組間差異不顯著(P>0.05)，菌群多樣性和豐度指數見表2。

表2 塔爾羊糞便菌群Alpha多樣性指數Table 2 Alpha diversity index of fecal microflora in captive tahr

2.4 大腸桿菌耐藥性 從20份糞便樣本中各分離出1株大腸桿菌，共20株。通過微量肉湯法檢測藥物敏感性，結果顯示，大腸桿菌分離株對磺胺類和四環素類耐藥率均為5%，總體耐藥率為10%；對β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、多黏菌素類和酰胺醇類藥物全部敏感，見表3。

表3 大腸桿菌耐藥表型Table 3 Escherichia coli drug resistance profile (%)

3 討論

本試驗利用Illumina MiSeq高通量測序方法對12份塔爾羊糞便樣本進行分析，共鑒定出18個門、32個綱、41個目、76個科、168個屬。通過稀釋曲線、Rank abundance曲線和Alpha多樣性指數進行樣本的復雜度分析，測序深度已基本覆蓋所有細菌。試驗結果可見塔爾羊糞便菌群優勢菌門為厚壁菌和擬桿菌門，這也是典型的反芻動物腸道微生物，與趙貴軍等[4]對林麝糞便菌群的研究和靳長青等[5]對灘羊腸道菌群的研究結果相同。厚壁菌在降解粗纖維的消化過程中發揮重要的作用[6]，擬桿菌主要功能是降解寡糖[7]，本試驗中成年組和亞成體組中優勢菌門總含量分別為90.50%和89.56%。從門、目水平對成年組和亞成體組菌群組成豐度進行對比分析，差異均不顯著(P>0.05)。在屬水平上，成年組孢桿菌屬含量顯著高于亞成體(P<0.05)，其他菌屬差異不顯著(P>0.05)。本試驗中亞成體組塔爾羊年齡在1.5～4.0歲，成年組在5～10歲，兩組動物在飼料供給和攝取上基本相同，可見在相同圈養環境條件下食物結構可能對動物群體腸道菌群的分布起到重要的作用。

細菌耐藥問題日益嚴重，腸桿菌科細菌作為腸道內的常見陰性菌，是開展耐藥細菌流行病學調查和研究的重要指示菌。反芻動物口服抗生素會對瘤胃微生物群落的發育、繁殖有強烈的抑制作用，可導致菌群失衡，因此抗菌藥物的使用量比其他種類動物要少，但也有報道顯示從不同反芻動物中分離的大腸桿菌存在較高的耐藥性：王顯峰等[8]分離的羊源大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林等9種藥物耐藥率在53.3%以上；盧婷[9]分離的牛源大腸桿菌對22種抗菌藥物均產生不同程度的耐藥性，其中有7種抗菌藥物的耐藥率超過50%；陸曉健等[10]從草食野生動物糞便中分離的大腸桿菌對復方新諾明的耐藥性為57.64%。本試驗通過細菌培養的方式分離塔爾羊糞便中的大腸桿菌，對其耐藥性進行檢測，結果顯示，塔爾羊種群糞便大腸桿菌對磺胺甲噁唑和四環素的耐藥率均為5%，對β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、多黏菌素類、酰胺醇類藥物均敏感，總體耐藥率為10%，低于陳家露等[11]和劉晨陽[12]對羊源大腸桿菌耐藥性的檢測結果，相同的是磺胺類和四環素類藥物耐藥性高于其他類抗生素。磺胺類抗菌藥通過干擾細菌內葉酸合成發揮抑菌作用，細菌主要通過產生低親和力的二氫葉酸合成酶以獲得耐藥性。四環素類藥物是與細菌的核糖體結合，干擾細菌蛋白質的翻譯達到抑菌目的，其外排泵蛋白和降解酶的出現使得細菌對四環素類抗菌藥產生耐藥性[13]。這兩大類藥物都是廣譜抗菌藥，在獸醫臨床上發揮重要作用，野生動物抗感染治療一般為個體給藥，也沒有作為促生長劑添加使用，這是耐藥性相對較低的主要原因，但磺胺和四環素類藥物耐藥基因都主要位于質粒上[14-16]，因此要注意防止質粒傳播造成的耐藥性擴散。

本試驗獲得的成年和亞成體健康塔爾羊糞便菌群結構，為塔爾羊人工飼養提供數據，未來會針對性的研究腸道菌群變化與疾病之間潛在的關系，為種群的疾病監測和治療提供新思路。對塔爾羊種群大腸桿菌耐藥性的研究提示該種群應注意抗菌藥物的選擇與合理使用，近期應謹慎使用磺胺類和四環素類藥物的使用，并注重耐藥性的長期監測，防止耐藥范圍的進一步擴大。