紫花補(bǔ)血草提取物對(duì)犬乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

姜琳琳 ， 孫曉宇 ， 趙塵培 ， 王 瑩 ， 朱洪偉 ， 張建龍 ， 于 馨 ， 陳國(guó)忠 ， 張興曉

(1. 魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ， 山東 煙臺(tái) 264025 ； 2. 煙臺(tái)市芝罘區(qū)疾病預(yù)防控制中心 ， 山東 煙臺(tái) 264000)

紫花補(bǔ)血草[Limoniumfranchetii(Debx.)Kuntze]屬白花丹科(Plumbaginaceae) 補(bǔ)血草屬(LimoniumMiller)，為中國(guó)特有種，又名煙臺(tái)補(bǔ)血草。補(bǔ)血草屬植物作為中草藥，具有補(bǔ)血、散瘀、抗菌消炎及抗腫瘤等功效，但有關(guān)紫花補(bǔ)血草的活性成分及藥理作用的研究較少[1-4]。目前，犬腫瘤的治療多采用手術(shù)結(jié)合放化療進(jìn)行，盡管治療效果有一定改善，但化療藥品毒副作用較大[5-6]。中草藥作為天然藥物，在治療腫瘤過(guò)程中，不僅可以減輕化療的毒副作用，而且不易產(chǎn)生耐藥性，具有較好的應(yīng)用前景[7-8]。因此，本研究以犬乳腺癌原代細(xì)胞為體外模型，采用紫花補(bǔ)血草提取物處理犬乳腺癌細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移的影響，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)犬腫瘤治療的天然藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 紫花補(bǔ)血草，采自煙臺(tái)市芝罘島海邊山坡；犬腫瘤組織來(lái)源于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院就診的病例。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)及MTT試劑，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胰蛋白酶，購(gòu)自上海碧云天公司；TRIzol、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒、LC-MS用各化學(xué)試劑(色譜純)，均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix (High ROX Premixed)試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 主要儀器 超高效液相色譜儀、質(zhì)譜、C18色譜柱、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超微量分光光度計(jì)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；低速離心機(jī)，湘儀公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯提取物的制備 取干燥的紫花補(bǔ)血草以粉碎機(jī)粉碎，用95%乙醇浸提3次,合并提取液，減壓濃縮，得到總浸膏，加蒸餾水?dāng)嚢杈鶆虺蓱腋∫海b入分液漏斗中，水層用乙酸乙酯萃取。將乙酸乙酯減壓濃縮回收溶劑后，干燥，稱重，備用。

1.4.2 紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯提取物成分檢測(cè)分析 取100 mg樣品置于EP管中，加入含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液500 μL，渦旋震蕩，冰浴靜置5 min，15 000 r/min、4 ℃離心10 min。取一定量的上清，加質(zhì)譜級(jí)水稀釋至甲醇含量為53%，并置于離心管中，15 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，收集上清，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)進(jìn)行分析，進(jìn)樣量10 μL。柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL/min；質(zhì)譜采用正離子模式時(shí)，流動(dòng)相為0.1% 甲酸(A)-甲醇(B)；質(zhì)譜采用負(fù)離子模式時(shí)，流動(dòng)相為5 mmol/L醋酸銨(pH=9.0)(A)-甲醇(B)。將下機(jī)數(shù)據(jù)(.raw)文件導(dǎo)入CD搜庫(kù)軟件中，對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對(duì)齊等分析，整合目標(biāo)離子，通過(guò)分子離子峰和碎片離子進(jìn)行分子式的預(yù)測(cè)并與mzCloud、MassList和mzVault數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，用對(duì)照樣本去除背景離子，對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行歸一化，最后得到數(shù)據(jù)的鑒定結(jié)果。

1.4.3 犬腫瘤組織石蠟切片H.E.染色 將犬腫瘤組織用4%的多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，使用常規(guī)石蠟進(jìn)行包埋。將其進(jìn)行連續(xù)切片之后，依次進(jìn)行染色、脫水、透明以及封固，待切片完全干燥后置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4.4 犬乳腺癌細(xì)胞中Ki67及HER2基因的表達(dá) 按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)收集到的正常乳腺組織、乳腺癌組織及原代乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行Ki67、HER2總RNA的提取。取RNA樣品 2 μL，用超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000對(duì)RNA在260 nm下的吸光度進(jìn)行定量測(cè)定。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。取4 μg RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA。按照實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，總共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，引物序列見(jiàn)表1，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Real-time PCR primers

1.4.5 細(xì)胞培養(yǎng) 將無(wú)菌條件下手術(shù)切除的腫瘤組織，無(wú)菌PBS清洗3次，修剪除去纖維組織，將組織塊剪成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm的小塊，無(wú)菌鑷子將組織種植于24孔板中，瓶?jī)?nèi)加入DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞濃度達(dá)到70%～80%融合后，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，傳代后腫瘤細(xì)胞種植于25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。加入適量膠原酶置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化2 h，加入10%胎牛血清終止消化。取上清，1 000 r/min離心5 min。將細(xì)胞沉淀PBS洗2次，重懸于含20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞濃度達(dá)到70%～80%融合后，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，傳代后腫瘤細(xì)胞種植于25 cm2培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.6 MTT法檢測(cè)紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯提取物對(duì)犬乳腺腫瘤原代細(xì)胞增殖的影響 將180 μL犬乳腺癌細(xì)胞接種于96孔板中，每孔10 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜。空白孔為DMEM培養(yǎng)基(不接種細(xì)胞)；陰性對(duì)照孔加入PBS；將紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯提取物配制成初始濃度為1 mg/mL的母液，對(duì)倍稀釋6個(gè)濃度梯度，依次加入試驗(yàn)孔中，每孔20 μL，終濃度分別為100、50、25、12.5、6.25 μg/mL和3.125 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)96 h，棄掉上清，加入20 μL MTT溶液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，加入150 μL的DMSO溶液，搖床振蕩5 min，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光值，計(jì)算不同濃度下腫瘤細(xì)胞的存活率以及細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)。

細(xì)胞存活率/%=(OD試驗(yàn)孔-OD空白孔)/

(OD陰性對(duì)照孔-OD空白孔)×100%

1.4.7 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞遷移能力 將犬乳腺癌細(xì)胞接種于24孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜。取200 μL的槍頭垂直于孔板進(jìn)行細(xì)胞劃痕，保證各個(gè)劃痕寬度一致，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS輕柔沖洗3次，然后加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照組加入PBS，試驗(yàn)組加入15 μg/mL提取物進(jìn)行處理，每組3個(gè)復(fù)孔，處理48 h。以劃痕后時(shí)刻為0 h，在48 h跟蹤拍攝各孔劃痕狀態(tài)，采用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞劃痕寬度。計(jì)算劃痕抑制率。

抑制率/%=(1-Δd試驗(yàn)組/Δd對(duì)照組)×100%

其中，Δd=寬度0 h-寬度24 h。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用ANOVA進(jìn)行多組間差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯提取物化學(xué)成分分析 采用超高效液相色譜儀聯(lián)用四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC-ESI-MS)，對(duì)紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯提取物進(jìn)行定性分析(圖1)，在正離子掃描模式下，共鑒定263種化合物；在負(fù)離子模式下，共鑒定228種化合物，排名前20的如表2所示。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MC)結(jié)果鑒定表明，紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯部位含有活性較強(qiáng)的天然黃酮類(lèi)物質(zhì)槲皮苷、香葉木素、木犀草素等。

圖1 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)正離子模式下鑒定結(jié)果(A)與負(fù)離子模式下鑒定結(jié)果(B)Fig.1 Application of LC/MS technology under positive ion mode (A) and negative ion mode (B)

表2 紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯部位化學(xué)成分的LC-MS鑒定結(jié)果Table 2 LC-MS identification of ethyl acetate extract of Limonium franchetii

2.2 犬乳腺腫瘤組織H.E.染色 經(jīng)H.E.染色后鏡檢，該犬乳腺腫瘤細(xì)胞大小不一，呈圓形或卵圓形/梭形等，染色較深，嗜堿性(圖2)，說(shuō)明此腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，分化程度低，異型性明顯，細(xì)胞惡性程度較高。

2.3 犬乳腺腫瘤原代細(xì)胞的分離 犬乳腺癌細(xì)胞原代細(xì)胞培養(yǎng)成功，組織塊種植后，可見(jiàn)細(xì)胞自組織塊周邊爬出(圖3)。原代腫瘤細(xì)胞7～9 h后貼壁，細(xì)胞核、細(xì)胞膜輪廓明顯，細(xì)胞形態(tài)多樣，多為呈圓形或橢圓形，貼壁生長(zhǎng)良好。

圖2 犬乳腺惡性腫瘤的組織病理學(xué)檢測(cè)(H.E.染色，400×)Fig.2 Histopathology of canine breast malignanttumor(H.E.staining,400×)

圖3 犬乳腺癌原代細(xì)胞(400×)Fig.3 Canine breast cancer primary cells (400×)

2.4 犬乳腺腫瘤組織中基因Ki67、HER2的表達(dá) 針對(duì)分離的犬乳腺癌組織及原代細(xì)胞進(jìn)行犬乳腺癌免疫標(biāo)志物Ki67及HER2的基因分析。許多研究已經(jīng)證實(shí)，Ki67與HER2過(guò)表達(dá)均與犬乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[9-13]，對(duì)腫瘤良惡性的鑒別診斷具有重要價(jià)值。結(jié)果顯示，惡性腫瘤的Ki76表達(dá)量是正常乳腺組織的4.31倍，具有顯著性差異(P=0.007)；HER2的表達(dá)在乳腺腫瘤組織中約為正常乳腺組織的2.38倍，具有顯著性差異(P=0.003)；而Ki67及HER2在原代乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)與腫瘤乳腺組織一致，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.923)(圖4)。

圖4 犬乳腺癌細(xì)胞中Ki 67與HER 2的mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.4 mRNA relative expression of Ki 67and HER 2 genes in canine breast cancer cells**：P<0.01

2.5 紫花補(bǔ)血草提取物對(duì)犬乳腺腫瘤原代細(xì)胞增殖的影響 采用不同濃度提取物對(duì)犬乳腺癌細(xì)胞處理48 h后，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，見(jiàn)圖5。隨著紫花補(bǔ)血草提取物濃度的遞增，細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，存在一定的劑量依賴性。當(dāng)藥物濃度為100 μg/mL時(shí)，與對(duì)照組比較，抑制率為79.75%。采用Graphpad Prism 8.0軟件計(jì)算得到提取物的IC50值為29.11 μg /mL。結(jié)果表明，紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯提取物對(duì)犬乳腺癌細(xì)胞的抑制作用較為明顯(P<0.05)。

圖5 紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯提取物對(duì)犬乳腺癌細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effects of Limonium franchetii ethyl acetate extract on proliferation of canine breast cancer cells

2.6 紫花補(bǔ)血草提取物對(duì)犬乳腺腫瘤原代細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)提取物濃度為15 μg/mL時(shí)，與對(duì)照組相比，犬乳腺癌細(xì)胞的遷移能力明顯受到抑制(P<0.05)，抑制率為57.14%(圖6)。

圖6 紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯提取物對(duì)犬乳腺癌細(xì)胞劃痕愈合程度的影響(200×)Fig.6 Inhibitive effects of Limonium franchetii ethyl acetate extract on canine breast cancer cells in cell injury healing experiment (200×)

3 討論

乳腺腫瘤是犬常見(jiàn)的腫瘤性疾病，且大多為惡性腫瘤，具有較高的死亡率，嚴(yán)重威脅犬類(lèi)的生活健康[14]。犬的乳腺腫瘤與人的乳腺腫瘤在許多方面有著類(lèi)似的特征，如組織形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)等。其中，腫瘤標(biāo)志物是乳腺腫瘤的良惡性鑒別診斷的有效依據(jù)，并且在預(yù)后及指導(dǎo)治療過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15]。許多研究已證實(shí)，Ki67及HER2可作為乳腺腫瘤的標(biāo)志物，用于診斷前、指導(dǎo)治療和預(yù)后判斷。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，Ki67及HER2基因的mRNA在惡性腫瘤組織中的表達(dá)均高于正常組織，這與Kaszak等[16]報(bào)道的結(jié)果是一致的。

目前，手術(shù)治療方法是臨床上治療犬乳腺疾病的常用方案，聯(lián)合化療來(lái)提高動(dòng)物的生存率。但化療給患犬帶來(lái)的反復(fù)嘔吐與腹瀉等不良反應(yīng)嚴(yán)重降低患犬的生活質(zhì)量，使得化療方案在治療寵物腫瘤疾病的應(yīng)用推廣受阻，近幾年，中草藥以低毒、高效、減少化療副作用等優(yōu)點(diǎn)，在人類(lèi)腫瘤治療中有廣泛的應(yīng)用，但未能廣泛的應(yīng)用于犬乳腺腫瘤的治療中。因此，尋找天然的具有抗腫瘤活性的中草藥，在犬腫瘤的治療應(yīng)用中具有重要意義。

國(guó)外目前尚未見(jiàn)對(duì)紫花補(bǔ)血草的研究報(bào)道，對(duì)補(bǔ)血草屬其他植物的化學(xué)成分和藥理活性進(jìn)行闡述的資料較少。近年來(lái)，對(duì)天然植物黃酮的研究表明其在抗腫瘤方面具有較好療效[17]，而前期對(duì)紫花補(bǔ)血草化學(xué)成分的研究也表明其中含有大量黃酮類(lèi)物質(zhì)。大量的研究顯示，植物黃酮類(lèi)成分例如槲皮素、異槲皮苷、木樨草素、芹菜素等可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，還能拮抗化療藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒性、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥[18]。嚴(yán)衛(wèi)等研究了中華補(bǔ)血草多酚對(duì)白血病HL-60細(xì)胞的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[19]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，紫花補(bǔ)血草中含有大量天然黃酮類(lèi)物質(zhì)槲皮苷、香葉木素、木犀草素等，并對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用。

為了進(jìn)一步明確紫花補(bǔ)血草黃酮類(lèi)化合物的抗腫瘤機(jī)制，本試驗(yàn)運(yùn)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)，檢測(cè)紫花補(bǔ)血草提取物對(duì)細(xì)胞遷移的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，紫花補(bǔ)血草乙酸乙酯提取物處理后，劃痕距離變小，可以顯著抑制細(xì)胞遷移進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，提示紫花補(bǔ)血草生物活性物質(zhì)可抑制犬乳腺癌細(xì)胞的遷移，可能是該提取物發(fā)揮抗腫瘤活性的機(jī)制之一。

綜合細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移試驗(yàn)結(jié)果，初步表明紫花補(bǔ)血草提取物具有抗犬乳腺腫瘤的活性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與降低腫瘤細(xì)胞遷移水平有關(guān)。由于補(bǔ)血草屬植物作為傳統(tǒng)的中草藥，具有較高的臨床安全性，因此，有望應(yīng)用于臨床犬腫瘤的治療。