不同感染階段奶牛糞便副結核分枝桿菌的排逸狀況分析

陳豐偉 ， 曹 杰 ， 馬 翀 ， 張 巽

(1.海南農墾草畜產業集團有限公司 ， 海南 澄邁 571900 ； 2.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193 ；3.中牧實業股份有限公司 ， 北京 豐臺 100071)

奶牛副結核(Paratuberculosis),又稱約內氏病(Johne′s disease,JD)，是一種慢性肉芽腫胃腸道疾病，其致病菌為副結核分支桿菌(Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis，MAP)。JD牛可通過糞便以及牛奶傳播MAP，易感牛只經口攝入后即可感染。Nielsen等關于JD牛不同感染階段排放MAP情況的論述有[1]：一是JD牛在感染初期并不排菌，隨著時間的延長會逐漸排菌；二是亞臨床期雖不表現癥狀，但會向環境中間歇排菌；三是臨床期表現腹瀉癥狀后，會持續大量排菌。目前對于此病暫無有效的治療，且無疫苗，因此JD牛持續大量排菌應當立即淘汰。

JD的防控應首先做好感染牛的標記與隔離，然而JD的檢疫受到多種因素影響：一是感染早期牛主要以細胞免疫為主，降低了血清ELISA試驗的敏感性[2]；二是亞臨床期可能會通過糞便間歇性排放少量MAP，從糞便中分離和培養病原菌存在一定困難。世界動物衛生組織(OIE)于2014年頒布的相關文件提及JD檢疫金標準仍然是糞便分離培養，這一檢測方法工作量大，成本高，耗時長(需要花費大約16周的時間)[3]。如今，PCR基因檢測技術正逐漸成為JD檢疫的重要手段，該方法可快速得出結果，并具備與糞便分離培養相接近的特異性和敏感性[4]。

本試驗選取北京地區某規模化奶牛場，收集MAP血清抗體陽性牛的糞樣，提取DNA后，使用MAP Real-time PCR試劑盒進行檢測，以期探明MAP血清抗體陽性牛的糞便排菌情況。

1 材料與方法

1.1 試驗對象 試驗牛場MAP血清抗體陽性率為11.13%。本試驗在2015—2016年進行了3個批次的糞便采樣和試驗。對MAP血清抗體陽性牛進行糞便采集，并記錄當時糞便性狀、腹瀉史情況。糞樣分裝于15 mL離心管，于-80 ℃冰箱凍存備檢。

1.2 試驗材料 糞便基因組DNA提取試劑盒，購自天根生物科技公司；MAP Real-time PCR試劑盒，購自Ingenasa公司。恒溫水浴鍋；干式加熱板；無水乙醇；離心管；移液槍；濾芯槍頭；MX-3005P實時熒光定量PCR儀，購自Stratagene公司；微量臺式離心機和通用臺式離心機，均購自Theromo Fisher公司。

1.3 試驗方法 按照天根糞便基因組DNA提取試劑盒說明書進行糞樣(180～220 mg)DNA提取操作，提取的DNA做好標記，于-20 ℃凍存備檢。使用Ingenansa MAP Real-time PCR試劑盒進行DNA鑒定。

1.4 數據處理 分析MAP血清抗體陽性牛的糞便MAP檢出情況，分析糞便性狀(感染階段)對糞便MAP檢出率的影響。

2 結果

2.1 MAP血清抗體陽性牛糞便Real-time PCR結果分析 共檢測189份MAP血清抗體陽性牛的糞便，MAP檢出率達到5.82%(表1)，說明MAP血清抗體陽性牛可通過糞便排菌污染牛場環境，威脅易感牛群。36.51%樣品結果無效，其原因可能是糞便中含有的植酸等物質干擾了PCR的酶反應。第3批次中有5個樣品為復檢樣品，2次檢測結果均為陰性或者無效。

表1 MAP血清抗體陽性牛糞便real-time PCR結果Tabel 1 Real-time PCR results of MAP-antibody seropositive dairy cattle

2.2 MAP血清抗體陽性牛糞便性狀統計 異常的糞便意味著牛的消化系統存在損傷并伴隨有腹瀉癥狀，因此以糞便性狀來確認牛有無腹瀉表現。糞便性狀異常，指的是水樣糞、稀糞。

MAP血清抗體陽性牛的糞便性狀異常率為11.11%(表2)，這一數值大于糞便MAP檢出率(5.82%)。性狀異常的糞便其MAP檢出率為28.57%，而性狀正常糞便的檢出率僅為2.98%(表3)。上述結果證明，感染牛處于亞臨床期或者臨床期均可排菌，MAP血清抗體陽性牛臨床期相比于亞臨床期，排菌概率提高了25.59%。

表2 MAP血清抗體陽性牛糞便性狀Tabel 2 Fecal character of MAP-antibody seropositive dairy cattle

表3 糞便性狀與糞便real-time PCR結果對比分析Tabel 3 Relationship between real-time PCR results and fecal characters

2.3 糞便檢出MAP的血清抗體陽性牛感染情況分析 糞便檢出MAP的血清抗體陽性牛中，54.55%(6/11)糞便性狀異常，45.45%(5/11)糞便性狀正常，表明不能單純通過糞便性狀判定其中是否含有MAP(表4)，因為亞臨床期MAP感染牛不表現癥狀，但仍可排菌[5]。有腹瀉史的牛占90.91%(10/11)，表明向環境中排放MAP的血清抗體陽性牛大部分發生過腹瀉或者正在腹瀉。編號為K的牛處于MAP感染的亞臨床期，無腹瀉史記錄，但已經通過糞便向環境中排放MAP。血清抗體陽性牛糞便Real-time PCR檢測陽性的占72.73%(8/11)。結合MAP感染引起機體體液免疫應答的特點，推測較晚檢出MAP血清抗體陽性牛的感染時間更靠后，即隨著時間的延長，感染牛糞便排菌的概率會逐漸升高。

表4 糞便檢出MAP的血清抗體陽性牛的real-time PCR具體結果Tabel 4 MAP real-time PCR results of MAP-antibody seropositive cattle

Real-time PCR技術可通過設定數個已知濃度的陽性對照，用于精確定量樣品中目標基因起始拷貝數(Copies)的濃度。拷貝數是指每克糞便樣品中所含有的MAP目的基因起始拷貝數，根據陽性梯度稀釋對照所得標準曲線方程計算后再換算獲得。第2批次的Real-time PCR試驗由于引物不足，陽性梯度稀釋對照無效，因此無法精確定量第2批次陽性樣品的起始拷貝數。

試驗結果顯示，排菌陽性牛的每克糞便的MAP目的基因起始拷貝數為5.12×104～3.88×108。其中每克性狀異常糞便平均含MAP目的基因起始拷貝數為1.49×108，正常糞便的則是4.67×106，由此可知MAP血清抗體陽性牛臨床期的排菌量是亞臨床期的32倍。

3 討論

目前國際上使用Real-time PCR試驗進行MAP相關研究已成為趨勢[6]。Real-time PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。相較常規PCR，Real-time PCR具有更高的特異性和靈敏性，同時還能做到精確定量檢測。Ingenasa公司的MAP Real-timePCR試劑盒是可用于進行含MAP DNA樣品的定性和定量的檢測。該試劑盒中的引物針對MAP特有的F57基因片段進行擴增，與引物匹配的TaqMan探針的熒光基團為FAM-BHQ1?。另外，該試劑盒還在MIX中添加了2種熒光基團，分別為JOE-BHQ1?和ROX，目的是排除假陰性以及可能被量化的計算錯誤。使用試劑盒中提供的標準陽性對照，并按照一定梯度稀釋，可以繪制lg(Copies)—循環閾值(Ct)標準曲線，進而計算出樣品中的起始拷貝數。

此次試驗共檢測189個糞樣，結果顯示Real-time PCR的糞便檢出率為5.82%，證明了MAP血清抗體陽性牛的糞便中可以檢出MAP，也說明了MAP血清抗體陽性牛不一定排菌。MAP血清抗體陽性牛糞便PCR結果的陰性率為57.14%。其原因可能是這些牛的病程尚未到排菌階段，也可能已經進入亞臨床期，但是呈現間斷性排菌，或當時排菌量低于檢測范圍。試驗中僅1頭牛糞便PCR結果為可疑，其原因可能是該樣品中MAP含量處于可疑范圍，應結合試劑盒說明書要求，重新采集血清抗體陽性牛的糞樣進行DNA提取操作。而對于結果無效的樣品，其無效的原因可能是因為樣品中含有的多糖、植酸干擾了PCR試驗。研究人員正在探索如何通過改良糞便DNA提取操作來提升MAP Real-time PCR試驗的敏感性[7]。例如由Adiavet公司生產的新型糞便提取試劑盒,借助于新技術Adiafilter，可以將檢測糞樣重量提高到3～10 g，使單個樣品檢測量增加并且更具代表性，從而提高Real-time PCR試驗的敏感性，同時還能保證PCR的酶反應免受糞便中其他物質的抑制[8]。

MAP血清抗體陽性牛相比于亞臨床期，臨床期向環境中排放MAP的概率提高了25.59%，且臨床期牛MAP排放量為亞臨床期牛MAP排放量的32倍。雖然處于亞臨床期的無腹瀉表現牛也可能排菌，但是考慮淘汰成本，建議對無腹瀉表現牛采取隔離措施，待其表現癥狀再淘汰。

本試驗通過病史調查發現，90.91%的MAP排菌牛有腹瀉史。盡管這些排菌牛的MAP排放量存在差異，但是均對奶牛的生活環境構成了污染，威脅牛群健康。綜上所述，牛場應對MAP血清抗體陽性牛進行標記和隔離，一旦出現腹瀉癥狀應立即淘汰。