匹莫苯丹關鍵中間體含量測定方法的建立

趙樂凱 ， 郝江南 ， 解龍霄 ， 崔亮亮 ， 王金泉 ， 郝智慧

(1. 新疆農業大學動物醫學院 ， 新疆 烏魯木齊 830001 ； 2. 中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193)

匹莫苯丹又名匹莫苯(Pimobendane)，是新一代的鈣增敏劑類強心藥物[1]。在獸醫臨床方面，匹莫苯丹已被美國食品藥品監督管理局批準用于犬類，治療繼發于慢性瓣膜性心臟病的充血性心力衰竭和擴張型心肌病[2]。匹莫苯丹的作用機制主要是增加肌絲的鈣敏感性,并且也有磷酸二酯酶抑制劑的作用和延長動作電位時間的作用[3]。Nautrup等[4]在地高辛和匹莫苯丹臨床對比試驗中發現，匹莫苯丹較地高辛明顯改善患犬心衰評價指標，并且不良反應較少。

目前關于匹莫苯丹合成的文獻[5-9]和專利[10-13]已有不少，從這些資料中可以看出，中間體[6-(3,4-二氨基苯基)-4,5-二氫-5-甲基-3(2H)-噠嗪酮(DPDMP)]是合成匹莫苯丹的關鍵中間體，其結構式見圖1。作為匹莫苯丹合成的關鍵中間體，該化合物的含量將會直接影響后續反應的進料,并最終影響匹莫苯丹的質量和收率,故其合成和含量都十分重要。目前，已有相關文獻[8-9]和專利[12-14]涉及此關鍵中間體的合成，但尚未見該中間體的液相色譜檢測方法的報道。本試驗建立了DPDMP的高效液相色譜(HPLC)檢測方法，并對其進行了驗證。

圖1 DPDMP結構式Fig. 1 Structural formula of DPDMP

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫1260型液相色譜儀(配DAD檢測器)，購自美國AgiLent公司；電子精密天平(ME203)，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 試劑與材料 DPDMP對照品，購自香港AOzeal公司，批號：ONL-017-29，含量：99.37%，規格：50 mg；DPDMP供試品，中國農業大學自制，批號：20170810；乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inter Sustain C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，GL Sciences Inc；流動相：20 mmol/L醋酸銨緩沖液(醋酸調至pH 5.5)-甲醇(75∶25，V/V)，進樣量：10 μL；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃。

2.2 溶液制備 DPDMP供試品溶液制備方法：精密稱取50 mg DPDMP樣品于燒杯中，取少量甲醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中，在量瓶中加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

DPDMP對照品溶液制備方法：供試品溶液準確取1.0 mL，加入至100 mL容量瓶中，加入甲醇，稀釋至刻度，搖勻，即得。

DPDMP對照品溶液制備方法：準確稱取10 mg DPDMP對照品于燒杯中，取少量甲醇溶解，轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統適用性試驗 按照2.2項下制備方法配制6份供試品溶液，按照上述色譜條件進行分析，記錄色譜圖。結果見表1。結果表明，DPDMP的理論塔板數均在2 000以上，保留時間的RSD小于2%，表明該方法系統適用性良好。

表1 DPDMP含量測定HPLC方法系統適用性試驗結果Table 1 System suitability test results for determination of DPDMP content by HPLC method

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍 精密量取DPDMP對照品貯備液適量，加流動相制成DPDMP含量分別為0.67、2.53、25.30、50.60、101.20、253.00 μg/mL和506.00 μg/mL系列濃度的對照品溶液，依照2.1項色譜條件，各個濃度進樣2次，進行檢測分析，分析后記錄色譜圖。結果見表2。以峰面積(A)為縱坐標，濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線(圖2)，其線性回歸方程：y=24.756 9x+18.651 8，R2=1.000 0。結果表明DPDMP的峰面積與其濃度呈較好的線性關系，可用來進行 DPDMP含量測定。

表2 DPDMP線性測定結果Table 2 Linearity determination results of DPDMP

圖2 標準曲線Fig.2 Standard curve

2.4.2 專屬性試驗 以2.1項溶液的配制方法分別配制 DPDMP供試品溶液、對照品溶液。分別量取空白溶劑、供試品溶液及對照品溶液各10 μL，按照2.1項色譜條件進樣檢測分析，并記錄色譜圖。結果見圖3～5。由色譜圖可知，空白溶劑對DPDMP的檢測無干擾，該方法的專屬性良好。

圖3 DPDMP空白溶劑色譜圖Fig.3 Blank solvent chromatogram of DPDMP

圖4 DPDMP對照品溶液色譜圖(0.1 mg/mL)Fig.4 Chromatogram of DPDMP reference solution

圖5 DPDMP供試品溶液色譜圖(0.1 mg/mL)Fig.5 Chromatogram of DPDMP test solution

2.4.3 檢測限和定量限 用流動相配制系列濃度DPDMP對照品溶液，分別進樣；記錄色譜圖和S/N，進行檢測限、定量限的測試。根據《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部“附錄9101獸藥質量標準分析方法驗證指導原則”，S/N=3對應的濃度為檢測限，S/N=10對應的濃度為定量限。結果顯示：DPDMP的檢測限為0.217 μg/mL,見圖6；DPDMP的定量限為0.650 μg/mL,見圖7。

圖6 DPDMP檢測限色譜圖(0.217 μg/mL)Fig.6 Detection limit chromatogram of DPDMP

圖7 DPDMP定量限色譜圖(0.650 μg/mL)Fig.7 Quantitative limit chromatogram of DPDMP

2.4.4 穩定性試驗 量取不同時間的供試品溶液，按照2.1項色譜條件進行檢測分析，并記錄其峰面積。結果如表3所示：DPDMP的峰面積RSD為0.99%，結果表明該溶液穩定性良好。

表3 DPDMP含量測定溶液穩定性結果Table 3 Solution stability results for determination of DPDMP content

2.4.5 重復性試驗 按照2.2項方法配制6份供試品溶液，以2.1項的色譜條件進行測試分析，記錄峰面積。同樣，根據對照品溶液的制備方法配制相應的對照品溶液，進行檢測分析，并記錄峰面積。結果如表4所示：平均峰面積為2 421.4，RSD為1.65%。該試驗結果顯示，DPDMP峰面積的RSD小于2%，表明本方法重復性良好。

表4 DPDMP含量測定重復性結果Table 4 Repeatability results for determination of DPDMP content

2.4.6 加樣回收率試驗 取9份已知準確含量的供試品溶液，分別加入匹莫苯丹關鍵化合物對照品，按照2.2項樣品制備方法和2.1項色譜條件進行分析，測定峰面積。結果如表5所示：DPDMP的加樣平均回收率為99.52%，RSD為0.86%，符合《中國獸藥典》2015年版[15]要求。結果表明本方法準確度好。

表5 DPDMP回收率試驗結果Table 5 Recovery test results of DPDMP (n=9)

2.5 樣品測定 取3批自制 DPDMP樣品，按照2.2項制備方法配制供試品溶液。并按照2.1項色譜條件進行檢測，檢測結果見表6。結果表明，采用HPLC法，測定 DPDMP的含量，操作簡單，專屬性良好。DPDMP三批樣品的含量均大于98.0%。

表6 3批 DPDMP樣品含量測定結果Table 6 Determination results of DPDMP samples in 3 batches

3 討論

DPDMP作為噠嗪酮類化合物，是匹莫苯丹合成工藝中的關鍵中間體，其含量對于制備匹莫苯丹的工藝而言，是十分重要的質量研究內容。本試驗根據高效液相色譜法測得的相關數據，建立了一套 DPDMP的高效液相色譜檢測方法，用于控制關鍵中間體的質量，即采用C18柱，以20 mmol/L醋酸銨緩沖液(醋酸調至pH5.5)-甲醇(75∶25，V/V)為流動相；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL；檢測波長為254 nm；柱溫為25 ℃。經過試驗證明該方法可以直接用于檢測DPDMP含量。本試驗開發的方法通過系統適應性試驗和方法學考察，表明該方法具有分析時間短、方法穩定準確、專屬性、重復性良好等優點，可用于DPDMP的質量研究。

目前針對DPDMP多為合成工藝的研究，而本試驗僅完成了含量測定方法的確定。下一步需要對DPDMP進行更多的質量研究，如性狀、鑒別(色譜法和光譜法)、有關物質及穩定性研究等，為匹莫苯丹及其制劑的質量控制提供更多參考依據。