大狼毒根部乙酸乙酯萃取物抑菌活性及急性毒性作用

李志玲 ， 項 勛 ， 劉清琦 ， 段 綱 ， 常 華 ， 楊林富

(云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 昆明 云南 650201)

大戟屬(Euphorbia)為大戟科(Euphorbiaceae) 中最大的屬，全世界共有2 000 余種，其中有80余種分布在我國，以西北和西南橫斷山區(qū)較多[1-2]。大戟屬藥用植物常常用于治療關節(jié)炎、水腫、結核、牛皮癬、疥瘡、無名腫毒等疾患[3]。該屬植物主要含有萜類、黃酮類、鞣質類等成分,具有抗腫瘤、抗白血病、抗病毒、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、瀉下、抗生育、保肝、抗氧化等活性[4-5]。

大狼毒(EuphorbiajolkiniiBoiss.)是大戟屬多年生草本植物，其根入藥，具有止血、消炎、祛風、消腫等功效[6-7]，作為一種生長于滇西亞高山草甸的典型毒害草，大狼毒可致草地退化，家畜誤食后中毒[8]。大狼毒的化學成分主要為二萜、三萜、甾體、鞣質等，具抗腫瘤、抗癌、抗病毒、保肝及誘導肝細胞分化等作用。同屬植物狼毒大戟富含豐富的二萜類成分，且部分化學成分在大狼毒中亦有發(fā)現(xiàn)；這些二萜類化合物具有抑制多種癌細胞生長、抗人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)作用以及抑制結核桿菌細胞壁的形成等藥理活性[9]，此外還有報道發(fā)現(xiàn)，狼毒大戟的石油醚及乙酸乙酯提取物具有一定毒性，這些研究都為該屬植物的進一步研究和開發(fā)提供了依據。但目前關于同屬植物大狼毒地下部分的抑菌活性及毒性研究尚無文獻報道。本試驗對大狼毒根部95%乙醇提取物的萃取相抑菌活性進行評價，并選取活性最好的乙酸乙酯萃取物進行急性毒性作用的研究，為獸醫(yī)開發(fā)大狼毒地下部分資源提供藥理學和毒理學資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及菌株 SPF級昆明小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，由云南省昆明醫(yī)科大學動物實驗部提供,實驗動物生產許可證號：SCXK(滇)2015—0002。在溫度(22±3) ℃，相對濕度40%～60%的動物房中適應性飼養(yǎng)5 d，食用標準飼料，自由飲水。

本試驗使用的菌株為購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心的金黃色葡萄球菌(CVCC1882)和豬霍亂沙門菌(CVCC2139)。

1.2 藥材及試劑 大狼毒根部采自云南香格里拉，由云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院藥理實驗室鑒定。95%乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、DMSO，均購自昆明普羅米商貿有限公司。細菌培養(yǎng)用酵母提取物及胰蛋白胨等，均購自海博生物技術有限公司。慶大霉素試紙及空白藥敏紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大狼毒提取方法 先將大狼毒根部清洗干凈、切片、曬干后粉碎成400目粉末，使用95%乙醇溶液對2 kg大狼毒根部粉末分5次進行冷浸提取，將藥液利用旋轉蒸發(fā)儀負壓濃縮，獲得總浸膏308 g(約為生藥含量的15.4%)。

采用液液萃取法，分別用石油醚、三氯甲烷和乙酸乙酯溶液依次萃取3次，將所得到的萃取物放置在60 ℃的恒溫烘箱中烘干，稱重。再用丙酮將萃取相配置成10 mg/mL濃度的藥液，取10片空白藥敏紙片放入裝有10 mL藥液的小瓶子，37 ℃烘箱烘干，含藥量為10 mg/片。

1.3.2 抑菌試驗 將處于生長對數期的金黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門菌以1×107CFU/mL的濃度，均勻涂布于LB培養(yǎng)基上后，將空白對照的空白藥敏紙片、陽性對照的慶大霉素藥敏紙片和各相藥敏紙片等距貼于平板上，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)12 h后測量各抑菌圈直徑，選擇抑菌效果最好的萃取相做3次平行抑菌效果評價。

用倍比稀釋法測定大狼毒根部乙酸乙酯萃取物的最小抑菌濃度(Minimal inhibit concentration，MIC)。試驗組為1～9號，用生理鹽水將乙酸乙酯萃取物稀釋成濃度為10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 mg/mL和0.039 mg/mL的藥液，每組取1 mL藥液加入含相同細菌數的5 mL LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)16～24 h，觀察培養(yǎng)基的渾濁程度，重復試驗3次，取其平均值。

1.3.3 受試物處理及急性毒性試驗

1.3.3.1 受試物的處理 稱取大狼毒根部95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取相50 g，用10%的DMSO配制成濃度為0.3 g/mL的懸浮液，超聲輔助溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3.2 急性毒性試驗 試驗根據GB15193.3—2014《急性經口毒性試驗》中寇氏法進行設計。首先，進行預試驗篩選出試驗的最高和最低劑量。將20只昆明小鼠隨機分成5組，每組4只，在尾部標記編號，單籠飼養(yǎng)，試驗前禁食6 h，不禁水。大狼毒根部乙酸乙酯萃取物藥液(用10%DMSO作為溶劑溶解)劑量組：1 000、2 000、4 000、6 000 mg/(kg·bw)和8 000 mg/(kg·bw)；試驗開始后于24 h內分3次灌胃給藥，每次灌胃體積不超過0.40 mL/只。給藥后連續(xù)觀察7 d，觀察小鼠毒性反應情況。若試驗中有小鼠死亡，則按照給藥劑量估計出小鼠全部死亡或90%以上死亡劑量和不死亡或10%以下死亡劑量，并將這2個劑量分別作為最高劑量[8 000 mg/(kg·bw)]和最低劑量[2 000 mg/(kg·bw)]。

正式試驗中將36只昆明小鼠隨機分成6個組(A～E組試驗組，F(xiàn)組對照組)，每組6只，等對數間距設置5個劑量水平，分別為：A組[2 000 mg/(kg·bw)]、B組[2 828 mg/(kg·bw)]、C組[4 000 mg/(kg·bw)]、D組[5 655 mg/(kg·bw)]、E組[8 000 mg/(kg·bw)]，F(xiàn)組灌胃等體積的10%DMSO(DMSO為溶劑)。灌胃給藥后12 h內觀察小鼠飲食、呼吸、行為、精神狀態(tài)是否異常，有無中毒癥狀或死亡現(xiàn)象等。若觀察期內發(fā)現(xiàn)有動物死亡，立即剖檢，肉眼觀察各臟器變化，采集有明顯病變組織做病理切片；未死亡動物在14 d觀察期結束后頸椎脫臼處死，并對處死小鼠進行剖檢后肉眼觀察臟器有無異常變化，并對異常臟器進行組織病理學觀察研究。

1.3.3.3 計算半數致死量 根據GB15193.3—2014《急性經口毒性試驗》中寇氏法計算相關公式算出大狼毒根部的乙酸乙酯萃取物的半數致死量(Median lethal dose，LD50)，公式如下：

式(1)

標準誤：

式(2)

95%可信限：

式(3)

其中：Xi+Xi+1為相鄰2個組的劑量對數之和；Pi+Pi+1為相鄰2個組動物死亡百分比；d為組距；n為樣本量。

2 結果

2.1 大狼毒根部萃取物抑菌作用 由圖1可知，3號乙酸乙酯相和5號慶大霉素的抑菌圈較大，而1號氯仿相和2號石油醚相抑菌圈不明顯；由表1可知，抑菌效果最好的乙酸乙酯相對金黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門菌的抑菌平均直徑值為1.7 cm和1.6 cm(注：其中慶大霉素藥敏紙片含藥量為10 μg/片,大狼毒根部萃取相藥敏紙片含藥量為10 mg/片)，且對2種細菌的MIC分別為1.25 mg/mL和2.5 mg/mL。

圖1 大狼毒根部萃取相抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of each extract from the root of Euphorbia jolkini BoissA:豬霍亂沙門菌; B:金黃色葡萄球菌; 1：石油醚相; 2：氯仿相; 3：乙酸乙酯相; 4：空白對照； 5：慶大霉素A:Salmonella cholerae-suis; B:Staphylococcus aureus; 1:Petroleum ether phase; 2:Chloroform phase; 3:Ethyl acetate phase; 4:Blank control; 5:Gentamicin

表1 藥敏紙片瓊脂擴散法抑菌直徑Table 1 Antibacterial diameter of antimicrobial susceptibility test (cm)

2.2 急性毒性試驗及LD50測定 經口給藥后，低劑量組(A組和B組)小鼠能在10 min內恢復正常行動，高劑量組(D組和E組)小鼠30 min內均出現(xiàn)中毒癥狀，閉眼蜷縮于角落，呼吸急促，對外界聲音刺激反應遲鈍。最高劑量E組[8 000 mg/(kg·bw)]小鼠在24 h內全部陸續(xù)死亡；D組[5 655 mg/(kg·bw)]中3只小鼠在中毒后第3天死亡，其中1只不斷抽搐，頭頸后仰，掙扎至死；而C組[4 000 mg/(kg·bw)]和B組[2 828 mg/(kg·bw)]小鼠中毒癥狀不明顯，分別于第3天各死亡3只和1只；而最低劑量A組[2 000 mg/(kg·bw)]和F組小鼠除灌胃24 h后體重有所下降外，并未出現(xiàn)死亡。除去各組死亡小鼠，其余小鼠在14 d內未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡的情況。

表2 急性毒性試驗小鼠死亡情況Table 2 Mice death details of acute toxicity test

經計算，大狼毒根部的乙酸乙酯萃取相的LD50為4 229.607 mg/(kg·bw)，95%置信區(qū)間為3 405.807～5 252.669 mg/(kg·bw)。

2.3 內臟病理變化 對各劑量組死亡小鼠進行剖檢后均發(fā)現(xiàn)小鼠的胃腸嚴重鼓氣，指尖觸摸腸內糞便堅硬，但脫臼處死的高、中、低劑量組小鼠胃腸道肉眼觀察未見明顯異常；各組死亡小鼠的肝臟濁腫，有明顯的暗紅色淤血斑及針頭大小的出血點，其余臟器肉眼未見明顯病變。

采集對照組小鼠和試驗組死亡小鼠的肝臟進行病理組織學變化觀察，結果如圖2所示，對照組小鼠無論在低倍鏡或高倍鏡下肝小葉結構完整，肝細胞呈條索排列整齊，形態(tài)無異常；而低倍鏡下可見試驗組的小鼠肝小葉結構不完整，匯管區(qū)毛細血管充滿了紅細胞，高倍鏡下肝小葉中央靜脈及其周圍肝血竇擴展，充滿了紅細胞，肝細胞腫脹發(fā)生空泡變性，胞漿出現(xiàn)淡紅色顆粒狀，變性嚴重細胞核被水泡擠至細胞一側，胞漿空白。

圖2 小鼠肝臟切片(H.E.染色,400×)Fig.2 Liver sections of mice (H.E.staining，400×)A:對照組； B、C:試驗組； 黑色箭頭：水泡變性； 黑色圓圈和方框：空泡變性及肝血竇擴張； 紅色箭頭和紅線：炎性細胞浸潤A:Control group; B,C:Experience group; Black arrows:Vesicular degeneration; Black circles and boxes:Vacuolar degeneration and hepatic sinusoidal dilatation; Red arrows and red lines:Inflammatory cell infiltration

3 討論

大戟屬大狼毒地下部分化學成分豐富，其中不同骨架型的二萜類化合物具有分類學意義。據有關文獻報道，其單體成分的分離方法各異，且具有多生物學活性。日本名古屋大學化學研究所[11-13]在1972—1976年通過高速液相色譜柱層析法，從日本產大狼毒根部的甲醇提取物的苯萃取物中相繼分離得到松香烷型二萜Jolkinolides A、B、C、D和E以及千金子烷型二萜Jolkinols A、B、C和D。20世紀90年代，中國學者從大狼毒根部95%乙醇提取物的石油醚、苯、乙醚和乙酸乙酯萃取物中又發(fā)現(xiàn)了多個二萜、三萜和甾體類化合物[14-16]。2004年，Lee等[17]從大狼毒全株的80%丙酮水提取物中分離得到一種單寧，命名為Jolkinin。2013—2017年，國內研究人員又從其根部的乙醇提取物中分離出更多的二萜、三萜、苯丙素類、甾醇及鞣質類化合物，豐富了大戟科植物中二萜的骨架類型。本試驗研究對象是大狼毒根部95%乙醇提取物，并依極性萃取的各相萃取物，結合前人研究猜測本次提取的乙酸乙酯萃取相的成分富含二萜類化合物。

此外，前人對大狼毒化學成分的生物學活性研究包括了抗病毒、抗腫瘤、抗氧化作用等。Ito等[18]分離的3,3-di-O-methylellagic acid具有清除自由基和抑制脂質過氧化的作用，可減輕四氯化碳引起的小鼠肝臟損傷?？共《狙芯糠矫?，研究發(fā)現(xiàn)大狼毒中Putranjivain A主要影響HSV-2體外感染晚期階段，可抑制病毒的附著和滲透[19]，而Jolkinol A也具有明顯的抗RSV活性[20]。近20年，學者們在大狼毒抗腫瘤化學成分方面亦有研究，發(fā)現(xiàn)Jolkinolide D可抑制腫瘤侵襲基底膜，誘導人白血病HL-60腫瘤細胞凋亡[21]，Jolkinolide F對HL-60細胞和Hela細胞有細胞毒性[22]，6-O-咖啡酰基-16-羥基十六烷酸對MCF-7細胞和Hela細胞有輕微細胞毒性[23]。陳穎志[24]從大狼毒中分離的化合物對β-羥高鐵血紅素的形成有較好的抑制作用，并推斷其中的三萜類化合物是大狼毒的抗瘧成分。

目前，鮮有大狼毒毒理學方面的研究報道。1994年，Wu等[25]從云南產大狼毒根乳汁中的丙酮提取物中分離得到2種巨大戟型二萜酯的混合物，其對小鼠耳部皮膚具有刺激性。但近幾年研究人員推測其巴豆烷型二萜可能與之毒性和刺激性有關。2000—2013年，先后有狼毒大戟毒理學研究報道，其水煮濾液可致小鼠精子畸形，有明顯的致突變作用[26]，其超臨界二氧化碳萃取物的LD50為2.05 g/(kg·bw),屬于小毒物質[27]，而其石油醚提取物和乙酸乙酯提取物的LD50為31.03 mg/(kg·bw)和1 538.58 mg/(kg·bw)[28]。由此可見，狼毒大戟的毒性與其提取方式不同有關。本試驗中大狼毒乙酸乙酯萃取物的半數致死量接近5 000 mg/(kg·bw)，相對狼毒大戟乙酸乙酯部的毒性較小，這可能是二者乙酸乙酯萃取物的成分差異所致。

本試驗發(fā)現(xiàn)，大狼毒根部的乙酸乙酯萃取物具有較好的抑制金黃色葡萄球菌和豬霍亂沙門菌的作用，且一定劑量的該萃取物可至小鼠胃腸道嚴重脹氣，肝臟損傷作用甚至是死亡，但本試驗僅選擇了對畜禽疾病危害較重的菌株進行抑菌活性的研究，大狼毒乙酸乙酯萃取物及其單體化合物的抑菌譜還有待進一步探究。同時，本試驗結果可指導大狼毒根部的抗菌單體化合物的分離及純化，為開發(fā)這種有毒但二萜類化學成分豐富的植物提供了藥理學及毒理學試驗基礎和數據支撐。