海南三亞黑山羊腸道寄生蟲流行病學調查

菅憶晨 ， 盧晨陽 ， 王占銘 ， 李世杰 ， 朱建明 ，任瑞雪 ， 趙華林 ， 司紅彬 ， 菅復春

(1.廣西大學動物科學技術學院 ， 廣西 南寧 530000 ； 2. 河南農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 河南 鄭州 450046 ；3. 海南志勤畜牧業(yè)技術研究院有限責任公司 ， 海南 三亞 572000)

海南黑山羊是海南省唯一的地方優(yōu)良山羊品種，在海南省各市縣均有飼養(yǎng)。海南黑山羊具有耐高溫高熱、耐粗飼、抗病力強、肉用性能好等優(yōu)點，是中國熱帶地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖寶貴的品種資源[1]。近年來，海南省一直將黑山羊養(yǎng)殖作為海南畜牧業(yè)發(fā)展的重點之一，黑山羊出欄量也在穩(wěn)步增長。數據顯示，海南省2018年黑山羊出欄量為84.62萬只；僅2019年上半年，海南黑山羊出欄量就達到了46.94萬只[2]。在巨大的需求面前，海南黑山羊集約化養(yǎng)殖技術的不完善以及經驗不足，飼養(yǎng)人員防病意識和技術知識的缺乏等原因導致黑山羊各種疾病的發(fā)生[3]，給養(yǎng)殖戶造成嚴重的經濟損失。其中腸道寄生蟲感染可引起羊腹瀉、食欲不振、生長發(fā)育不良，嚴重可導致死亡[4]。目前，尚無海南黑山羊寄生蟲流行病學調查的相關報道，為了解海南黑山羊腸道寄生蟲感染情況，本試驗采集了海南三亞市3個黑山羊養(yǎng)殖場共計100份黑山羊糞便樣品進行檢測，為有效防控海南黑山羊腸道寄生蟲感染提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 采集樣品 2020年9月，在海南省三亞市兩家同等規(guī)模的集約化羊場(A養(yǎng)殖場和B養(yǎng)殖場)及B養(yǎng)殖場周邊散戶放牧黑山羊，直腸采集成年黑山羊糞便樣品共100份。標記樣品信息帶回實驗室，于4 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。其中A養(yǎng)殖場的黑山羊采樣時，已經近1年未用驅蟲藥物，黑山羊普遍偏瘦。而B養(yǎng)殖場及其周邊散戶放牧養(yǎng)殖的黑山羊采樣時，近6個月內沒有用過驅蟲藥物。被采樣黑山羊均無臨床癥狀。

1.2 樣本處理 每份糞樣分為3份，1份用于顯微鏡下形態(tài)學檢查，1份提取DNA，1份分裝在2 mL離心管中加2.5%重鉻酸鉀保存復查。

1.3 試驗方法

1.3.1 顯微鏡檢查 按參考文獻[5]方法對糞樣進行水洗離心沉淀、盧戈式碘染色以及飽和蔗糖溶液漂浮后進行顯微鏡檢測。

1.3.2 蟲種鑒定 根據顯微鏡檢測下觀察到的寄生蟲卵囊與蟲卵的大小、顏色和形狀結構等特征按文獻[6]對寄生蟲進行種類鑒定。并對有球蟲感染的樣品使用McMaster計數板按照公式計算寄生蟲感染強度的參數，即每克糞便中的蟲卵數(Eggs per gram, EPG)和每克糞便中的卵囊數(Oocyts per gram, OPG)。

EPG/OPG=(n1+n2)/2÷0.15×60÷2

其中：(n1+n2)/2 為平均每個計數室內的蟲卵數/卵囊數，0.15為每個計數室有效體積為0.15 mL，60為糞液總體積為60 mL，2為所用糞便克數為2 g。

1.3.3 DNA的提取 參照QMEGA Bio-Tek公司Stool DNA試劑盒說明書提取糞便DNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 PCR擴增 分別基于核糖體小亞基基因(SSU rDNA)位點分別對畢氏腸微孢子蟲、芽囊原蟲、十二指腸賈第蟲和隱孢子蟲進行PCR擴增。畢氏腸微孢子蟲、隱孢子蟲、十二指腸賈第蟲和芽囊原蟲的引物及反應程序按文獻[7-9]進行，除使用LATaq酶對十二指腸賈第蟲SSU rDNA進行共計2輪的巢式PCR擴增以及使用KOD-plus酶對芽囊原蟲進行1輪PCR擴增外，其他原蟲均使用KOD plus酶進行巢式PCR擴增。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，KOD-plus酶(日本TOYOBO公司)和LATaq酶(日本TaKaRa公司)，均購自鄭州科貿生物技術有限公司。試驗中設置陰性和陽性對照。PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳、GelRed染色檢測，陽性PCR產物由北京諾賽基因有限公司進行雙端測序。

1.4 序列分析和統計分析 用SeqMan軟件對獲得的基因序列進行校正，在NCBI網站GenBank中搜索相似序列，用Clustal X 2.11進行比對分析來鑒定隱孢子蟲、畢氏腸微孢子蟲和芽囊原蟲種類和十二指腸賈第蟲集聚體。使用Excel進行數據統計，同時采用SPSS 18.0 軟件進行數據處理，采用Pearson卡方檢驗計算差異率，P<0.05為具有統計學差異，P<0.01為統計學差異顯著，P<0.001為統計學差異極顯著。

2 結果

2.1 海南黑山羊腸道原蟲感染總情況 本次檢測的100份樣品中，腸道原蟲總感染率為83%(83/100)。共檢測到5種腸道寄生蟲，其中球蟲卵囊、線蟲蟲卵的檢出率分別為75%(75/100)和46%(46/100)，未檢測到阿米巴原蟲。PCR檢測到畢氏腸微孢子蟲、賈第蟲、芽囊原蟲共3類寄生蟲，陽性率分別為20%(20/100)、11%(11/100)和5%(5/100)，未檢測到隱孢子蟲。

本試驗采樣時選擇了三亞市兩家同等規(guī)模的海南黑山羊養(yǎng)殖場及養(yǎng)殖場周邊的一些散戶放牧黑山羊。其中A養(yǎng)殖場總感染率為98.43%(63/64)，B養(yǎng)殖場總感染率為35.29%(6/17)，B養(yǎng)殖場周邊散戶放牧羊總感染率為73.68%(14/19)。兩家養(yǎng)殖場及散戶放牧黑山羊之間腸道寄生蟲感染率差異極顯著(P<0.001)。

A養(yǎng)殖場的64份糞便樣品中檢測出5種常見腸道原蟲，感染率較高的為球蟲89.06%(57/64)和線蟲57.81%(37/64)，其次為畢氏腸微孢子蟲31.25%(20/64)、芽囊原蟲7.81%(5/64)和賈第蟲17.18%(11/64)。B養(yǎng)殖場的17份糞便樣品中僅檢測到球蟲1種常見腸道原蟲，感染率為35.29%(6/17)。B養(yǎng)殖場周邊的散戶放牧黑山羊19份糞便樣品中顯微鏡檢測出2種寄生蟲，分別為球蟲63.15%(12/19)和線蟲47.36%(9/19)，PCR未檢測到其他原蟲感染。

2.2 海南黑山羊腸道寄生蟲混合感染情況 本次檢測的100份海南黑山羊糞便樣品中共48份為2種及2種以上腸道寄生蟲混合感染，混合感染率為48%(48/100)，單種病原感染率為34%(34/100)。A養(yǎng)殖場的糞便樣品混合感染率占總混合感染率的85.41%(41/48)。散戶放牧黑山羊糞便樣品混合感染率占總混合感染率的14.28%(7/49)。A養(yǎng)殖場和散戶放牧黑山羊混合感染率差異極顯著(P<0.01)。B養(yǎng)殖場無混合感染，僅為單種病原感染，感染率為35.29%(6/17)。

A養(yǎng)殖場黑山羊糞便樣品中感染2種寄生蟲的樣品感染率為31.25%(20/64)，以球蟲和線蟲的混合感染占比最高，為75%(15/20)。感染3種腸道寄生蟲的樣品占26.56%(17/64)，主要以球蟲、線蟲和微孢子蟲為主，占64.7%(11/17)。同時感染4種腸道寄生蟲的占陽性樣品的4.68%(3/64)。5種腸道原蟲的混合感染率為1.56%(1/64)。散戶放牧黑山羊的混合感染率為36.84%(7/19)，均為球蟲和線蟲混合感染，占100%(7/7)。

2.3 海南黑山羊不同飼養(yǎng)模式感染情況 由表1可知，本次采樣時分別采集了圈養(yǎng)(54/100)和放牧(46/100)2種飼養(yǎng)模式，圈養(yǎng)模式總感染率為77.8%(42/54)，放牧模式總感染率為89.1%(41/46)，差異不顯著(P>0.05)。

表1 三亞市海南黑山羊腸道寄生蟲感染情況Table 1 General situation of intestinal parasite infections in Hainan black goats in Sanya city

其中，A場放牧為主的腸道寄生蟲感染率占放牧總感染率的65.85%(27/41)，以放牧為主的散戶黑山羊腸道寄生蟲感染率占放牧總感染率的34.14%(14/41)。A場圈養(yǎng)模式腸道寄生蟲感染率占圈養(yǎng)總感染率的85.71%(36/42)，B場以圈養(yǎng)為主要飼養(yǎng)方式的腸道寄生蟲感染率占總感染率的14.28%(6/42)。

A場放牧為飼養(yǎng)模式的腸道寄生蟲感染率為100%(27/27)，感染率較高的分別為線蟲92.59%(25/27)和球蟲85.18%(23/27)，接著為微孢子蟲44.44%(12/27)、賈第蟲14.81%(4/27)和芽囊原蟲7.4%(2/27)。散戶放牧黑山羊腸道寄生蟲感染率為73.68%(14/19)，主要為球蟲85.71%(12/14)和線蟲64.28%(9/14)。A場放牧山羊黑山腸道寄生蟲感染率與散戶放牧黑山羊腸道寄生蟲感染率差異顯著(P<0.05)。

A場圈養(yǎng)黑山羊腸道寄生蟲感染率為97.29%(36/37)，感染率較高的為球蟲94.44%(34/36)，其次為線蟲33.33%(12/36)、微孢子蟲22.22%(8/36)、賈第蟲19.44%(7/36)和芽囊原蟲8.33%(3/36)。B養(yǎng)殖場圈養(yǎng)黑山羊腸道寄生蟲感染率為35.29%(6/17)，僅檢測到球蟲感染，占100%(6/6)。A場與B場圈養(yǎng)模式下黑山羊腸道寄生蟲感染率差異極顯著(P<0.001)。

2.4 海南黑山羊腸道寄生蟲感染種類及球蟲感染強度 經顯微鏡形態(tài)學鑒定，本次調查共發(fā)現2種線蟲卵，分別是毛首線蟲和捻轉血矛線蟲；共5種山羊球蟲，分別為艾麗艾美耳球蟲(E.alijevi)、蒼白艾美耳球蟲(E.pallida)、家山羊艾美耳球蟲(E.hirci)、山羊艾美耳球蟲(E.caprina)和斑點艾美耳球蟲(E.punctata)，其中以艾麗艾美耳球蟲(E.alijevi)為優(yōu)勢蟲種，占鑒定樣品的25%(33/132)。對其中40份球蟲陽性樣品進行麥克馬斯計數，其OPG值介于2 000～5 000的有12份，5 000以上的有7份，其中最高的1份為放牧飼養(yǎng)模式中的陽性樣品，OPG值高達17 600。放牧、圈養(yǎng)黑山羊球蟲平均OPG值分別為2 012.5和2 450。不同飼養(yǎng)方式下球蟲OPG值分布見圖1。

圖1 不同飼養(yǎng)模式下羊球蟲感染強度(OPG)分布情況Fig.1 OPG distribution of Coccidia in different feeding modes灰色正方:圈養(yǎng)飼養(yǎng)模式; 黑色菱形:放牧飼養(yǎng)模式Gray square:Captive feeding mode; Black diamond:Grazing feeding mode

2.5 畢氏腸微孢子蟲基因型鑒定 共采集100份樣品，進行微孢子蟲PCR擴增，其中20份樣品擴增后出現目的片段，約392 bp(圖2)；經雙向測序后通過序列對比分析，共檢測出2種基因型，分別為BEB6和CHG28。BEB6中2條序列與我國北方馬畢氏腸微孢子蟲(MN704934)序列的同源性為100%，2條序列與我國西藏綿羊(MK573329)序列同源性為100%。CHG28中16條序列與我國山羊(MN845623)系列同源性為100%。

圖2 部分畢氏腸微孢子蟲的PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification results of some Entrerocytozoon bieneusi M:DL-2 000 DNA相對分子質量標準； 1：陰性對照；2：陽性對照； 3～7：樣品M:DL-2 000 DNA marker; 1:Negative control;2:Positive control; 3-7:Samples

2.6 十二指腸賈第蟲基因型鑒定 100份樣品中共擴增出11份十二指腸賈第蟲的目的片段，約292 bp(圖3)；雙向測序成功后通過序列對比分析發(fā)現僅檢測出Assemblage E基因型。其中7條序列與非洲尼日利亞山羊賈第蟲(MK487707)序列的同源性為100%，4條序列與我國新疆馬賈第蟲(MN174123)

圖3 部分賈第蟲的PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification results of some Giardia duodenum M:DL-2 000 DNA相對分子質量標準； 1：陰性對照；2：陽性對照； 3～7：樣品M:DL-2 000 DNA marker; 1:Negative control;2:Positive control; 3-7:Samples

序列的同源性為100%。

2.7 芽囊原蟲基因型鑒定 僅5份樣品擴增出芽囊原蟲目的片段，約600 bp(圖4)；將芽囊原蟲陽性樣品測序成功后通過序列對比分析，僅檢測出ST10基因型，并且5條序列與馬來西亞牛芽囊原蟲(MG831498)序列同源性為100%。

圖4 芽囊原蟲的PCR擴增結果Fig.4 PCR amplification results of BlastocystisM:DL-2 000 DNA相對分子質量標準； 1：陰性對照；2：陽性對照； 3～7：樣品M:DL-2 000 DNA marker; 1:Negative control;2:Positive control; 3-7:Samples

3 討論

本次調查中海南黑山羊腸道寄生蟲感染率偏高，混合感染以球蟲和線蟲感染為主，這可能與采樣季節(jié)或氣候以及飼養(yǎng)模式有關。三亞屬于熱帶海洋性季風氣候，年平均氣溫在25.7 ℃，氣候溫暖濕潤，十分有利于寄生蟲病的發(fā)生和傳播[10]。相關資料表明[11]，四川省部分地區(qū)黑山羊春、夏、秋寄生蟲感染率明顯高于冬季，并且以線蟲感染為主。這與本次調查結果相似(線蟲感染率占總感染率的55.42%)。因此，海南三亞地區(qū)的羊寄生蟲病應全年防控。此外，海南黑山羊以放牧飼養(yǎng)為主，一年四季均可在草地、林地和山嶺等各種環(huán)境放牧。近年來，由于養(yǎng)殖量增加，海南省生態(tài)保護政策加強，林地面積擴大，適合黑山羊傳統放牧的區(qū)域縮小，圈養(yǎng)模式逐漸增加。國內外有關羊腸道寄生蟲的調查均發(fā)現，放牧模式下線蟲感染率明顯高于圈養(yǎng)模式[12-13]，而且本試驗鑒定出的毛首線蟲和捻轉血矛線蟲均是對熱帶、亞熱帶地區(qū)畜牧業(yè)危害最廣泛、造成經濟損失最嚴重的寄生性線蟲，常常引起“春潮”導致宿主大批量死亡[14]。這2種消化道線蟲也是在牛、羊、駱駝等動物的小腸中較為常見和易于鑒定的蟲種[15]。可見放牧羊群更應該注重檢測和驅除線蟲。

本次調查的A養(yǎng)殖場圈養(yǎng)黑山羊腸道寄生蟲感染率高達98.43%，其中球蟲感染率為89.06%。在本次調查中共發(fā)現了5種山羊球蟲，其中艾麗艾美球蟲(E.alijevi)、山羊艾美尓球蟲(E.caprina)和家山羊艾美耳球蟲(E.hirci)均為感染山羊的常見球蟲種類，在埃及野生山羊以及巴基斯坦的野生山羊中均有過報道[16-17]。根據球蟲的馬克馬斯特計數可以看出球蟲卵囊排出強度差異很大，表明A養(yǎng)殖場黑山羊的球蟲感染普遍存在且呈持續(xù)感染狀態(tài)，這可能是該場羊只普遍偏瘦的直接原因，應引起養(yǎng)殖場的關注。A養(yǎng)殖場的感染率表明在高床圈養(yǎng)羊時也不可忽視圈舍衛(wèi)生管理，及時清理糞便，尤其是羊床漏縫地板之間的糞便污染物，并定期消毒和做好糞便無害化處理。此外，A養(yǎng)殖場的感染率較高的原因與采樣羊場近1年內未用驅蟲藥物也有很大關系。

在PCR檢測中發(fā)現了畢氏腸微孢子蟲、十二指腸賈第蟲和芽囊原蟲3種腸道原蟲，且都是可寄生于人和動物腸道的重要并廣泛流行的人獸共患寄生蟲，呈世界性分布。在系統發(fā)育分析中，微孢子蟲的基因型劃分為9個組，其中Group 1具有人獸共患性，羊主要感染Group 2中的基因型，其余組群基因型具有宿主特異性[18]。本次調查發(fā)現的微孢子蟲為Group 2中的2種基因型CHG28和BEB6，其中BEB6亞型宿主范圍廣，既可感染人，也可感染動物，具有潛在的人獸共患性。在云南烏骨羊[19]和西藏藏綿羊[20]腸道原蟲感染情況的報道中，微孢子蟲優(yōu)勢亞型均為BEB6，而本調查中CHG28為優(yōu)勢基因型，占畢氏腸微孢子蟲陽性樣品總數的85%(17/20)。十二指腸賈第蟲現已被分為8個不同的聚集體(Assemblage A～H)[21]，其中聚集體A和B是重要的人畜共患亞型，聚集體E則多在偶蹄動物中。芽囊原蟲現被分為17個亞型，ST1～9被認為存在人獸共患致病風險，ST10～17只在動物和水中檢測到。本次調查海南黑山羊發(fā)現十二指腸賈第蟲聚集體E基因型以及芽囊原蟲ST10基因型。本次檢測到的基因型也是在牛、羊和駱駝等動物中最為常見的亞型[22]。上述調查結果表明，腸畢氏微孢子蟲亞型分布存在地域或動物品種間的差異，十二指腸賈第蟲和芽囊原蟲感染亞型相對單一。分析造成海南黑山羊腸道寄生蟲感染種類和基因型偏少的原因可能為：首先，海南黑山羊是海南的獨特品種，長期以來只在海南島飼養(yǎng)，與其他省市少有品種交流和異地飼養(yǎng)情況，可能保持其獨特的寄生蟲感染譜和相對單一的原蟲基因亞型特點；其次，飼料、飼草、飼養(yǎng)氣候、地理位置等因素也可能是導致海南黑山羊與其他地區(qū)羊腸道寄生蟲感染種類差異的因素。尚需要加大對海南黑山羊流行病學調查覆蓋面和樣本數量來證實上述推測。

4 結論

本調查首次對三亞市海南黑山羊腸道寄生蟲進行流行病學調查和病原種類及基因亞型分析。結果表明黑山羊腸道寄生蟲感染率高，混合感染較為普遍。提醒養(yǎng)殖場應高度重視海南黑山羊羊腸道寄生蟲病的防控。