14種中藥對臨床大腸桿菌的體外抑菌效果

羅怡琳 ， 田 浪 ， 許娃麗 ， 羅卓琳 ， 吳保慶

(廣東海大集團(tuán)股份有限公司 ， 廣東 廣州 511400)

大腸桿菌病在我國養(yǎng)殖場中較為流行，且發(fā)病率和死亡率高居不下，對畜禽養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅，并帶來了巨大損失[1]。大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)血清型多達(dá)50種[2]，有研究表明，即便是同一地區(qū)不同養(yǎng)殖場間的優(yōu)勢血清型也不盡相同。長期以來為了控制大腸桿菌病的發(fā)生[3]，抗菌藥被廣泛、大量且不規(guī)范的使用在臨床養(yǎng)殖上，因此導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥問題愈發(fā)嚴(yán)重。當(dāng)前，為了響應(yīng)并遵循國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部無抗飼料的相關(guān)規(guī)定，尋求具有地域針對性的抗菌藥物成為研究熱點。

中藥作為我國國粹之一，具有資源豐富、價廉易得、安全無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，因此成為當(dāng)前尋找抗菌藥替代品的重要來源。許多中藥具有抗菌作用，部分中藥還可逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性，提高耐藥菌對抗菌藥的敏感性[4-7]。本試驗通過選取14種已報道的對家禽大腸桿菌具有抑制作用的中藥，對2株大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株以及22株廣東地區(qū)臨床分離的大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗，旨在篩選出對廣東地區(qū)大腸桿菌臨床菌株有抑菌作用的中藥，為臨床大腸桿菌病的用藥提供參考，同時也進(jìn)一步為中藥逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 中藥 板藍(lán)根、白頭翁、大青葉、大黃、金銀花、魚腥草、五倍子、蒲公英、黃芩、秦皮、黃連、苦參、穿心蓮、黃柏，均購自廣東省廣州市大參林藥店。

1.2 供試菌株 大腸桿菌ATCC25922、ATCC10389，均購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；臨床分離菌株：22株大腸桿菌菌株(2018年1月—2020年9月從廣東各地養(yǎng)殖場患病家禽中分離獲得)，由廣東海大畜牧水產(chǎn)研究中心分離保存。

1.3 儀器與試劑 超凈工作臺，購自江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；SPX型生化培養(yǎng)箱，購自寧波東南儀器有限公司；微量移液器，購自賽默飛世爾科技公司；營養(yǎng)瓊脂、MH瓊脂、MH 肉湯、K-B紙片，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 中藥藥液的制備 采用水煎法[8]稱取潔凈干燥藥材剪碎后置于燒杯中，加入10倍量的蒸餾水沒過藥材約1 cm，浸泡20 min后用電爐微沸騰加熱1 h左右，然后使用8層紗布進(jìn)行過濾，剩余藥渣再次加入5倍量的蒸餾水煮沸30 min后過濾，將2次藥液合并后離心過濾并進(jìn)行10倍濃縮，得到濃度為1 g/mL藥液，高壓滅菌后于4 ℃冰箱保存。

1.5 菌液的制備 將保存的大腸桿菌ATCC25922、ATCC10389標(biāo)準(zhǔn)菌和22株臨床分離菌在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線培養(yǎng)后，挑取單個菌落接種于MH 肉湯中培養(yǎng)12～16 h，作為原菌液，備用。

1.6 MH平板的制備 將滅菌后的MH瓊脂培養(yǎng)基傾注至無菌干燥的平皿內(nèi)，待培養(yǎng)基冷卻后形成厚度為4 mm 的平板。制成的MH 平板取出1個置37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h做無菌檢測，其余用密封袋封好置4 ℃冰箱保存，7 d 內(nèi)用完[9]。

1.7 抑菌試驗

1.7.1 抗菌藥體外抑菌試驗 采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗，通過測量各紙片的抑菌圈大小(mm)，參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》及美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)《抗菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)》2013 版，評定為敏感、中敏和耐藥。

1.7.2 中藥體外抑菌試驗 采用管碟法。用無菌棉簽蘸取濃度為105～106CFU/mL 的細(xì)菌稀釋液，涂布于MH 平板上，用無菌鑷子將鋼管均勻擺放平板上，靜置10～15 min，滴加中藥藥液，加至液面與鋼管表面平行即可，每種藥物做3個重復(fù)。將平板放置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12～18 h 后，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小，取平均數(shù)為統(tǒng)計結(jié)果。結(jié)果判定：抑菌圈直徑≥20 mm為極敏，抑菌圈直徑在15～19 mm為高敏，抑菌圈直徑在10～14 mm為中敏，抑菌圈直徑<10 mm為低敏，無抑菌圈為耐藥[10]。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 抗菌藥對臨床菌株體外抑菌試驗 使用14種不同抗菌藥對臨床22株大腸桿菌菌株進(jìn)行抑菌試驗，并統(tǒng)計抑菌效果，結(jié)果如表1所示，22株臨床大腸桿菌對多黏菌素B、頭孢曲松、慶大霉素、大觀霉素、頭孢曲松、新霉素均表現(xiàn)出不同程度的高度敏感，其中對多黏菌素B(20株)敏感度最高；而對林可霉素、利福平、多西環(huán)素、新諾明均表現(xiàn)為耐藥。

表1 抗菌藥對大腸桿菌臨床菌株的體外抑菌效果Table 1 In vitro antibacterial effect of antibiotics on E.coli clinical strains

2.2 14種中藥對標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效果 結(jié)果如表2所示，14種中藥中苦參、穿心蓮、黃柏對標(biāo)準(zhǔn)菌株無抑菌作用，其余11種中藥對2種標(biāo)準(zhǔn)菌株表現(xiàn)出不同程度的抑菌效果。

表2 14種中藥對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of 14 traditional Chinese medicines on E.coli reference strains

2.3 14種中藥對臨床菌株的抑菌效果 14種中藥中僅白頭翁、金銀花、五倍子、秦皮、黃連、大青葉6種對臨床大腸桿菌菌種有抑菌作用，且效果均為中效，其中以金銀花、五倍子、白頭翁3種藥物抑菌效果相對最佳(表3)。

表3 14種中藥對大腸桿菌臨床菌株的抑菌效果Table 3 Antibacterial effect of 14 Chinese medicines on E.coli clinical strains

3 討論

關(guān)于中藥體外抑菌的測定方法較多，最為常見的為二倍稀釋法、紙片法、管碟法、打孔法等。二倍稀釋法在操作過程中需要調(diào)節(jié)藥液的酸堿性，藥液的pH對結(jié)果影響較大且不易把控，同時顏色較深的藥液顏色不便于觀測；因根莖部藥液淀粉含量較高，液體黏稠度加大，使用打孔法時滴在孔內(nèi)的藥液難以擴(kuò)散，故以上2種方法都有局限性。紙片法技術(shù)上雖簡單易行，但紙片所吸附的藥量不好確定，且吸附到紙片上的藥液又不易擴(kuò)散，同時在自制藥敏紙片時需要反復(fù)烘干，對藥液中有效物質(zhì)的揮發(fā)有一定影響作用，所以該方法對藥物的抑菌效果影響較大[11]。而管碟法不需要對藥液進(jìn)行額外處理，且可以精確的量取藥液，試驗結(jié)果較為準(zhǔn)確，故本試驗采用此方法進(jìn)行抑菌試驗。

雞大腸桿菌病是雞的養(yǎng)殖業(yè)中常見的細(xì)菌性疾病，發(fā)病率高且血清型多，不同血清型對藥物的敏感性不一致，不同地區(qū)同一血清型的大腸桿菌對藥物的敏感性也各不相同[12]。李蘭芳等[13]通過對青海省內(nèi)規(guī)模化豬場致病性大腸桿菌的血清型進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，青海省內(nèi)不同地區(qū)的養(yǎng)殖場間的優(yōu)勢血清型也具有明顯差異；羅銘等[14]報道顯示，玉林市禽、畜養(yǎng)殖場沙門菌的優(yōu)勢血清型間具有顯著差異。同時，有學(xué)者對致人腹瀉的志賀氏菌與非傷寒沙門菌連續(xù)8年的菌型變遷進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，各地對菌型分布的報告不盡相同，即使在同一地區(qū)的不同年代，其分布也不完全一致，其耐藥情況也有較大改變[15-16]。本試驗所分離的大腸桿菌菌種均來自廣東地區(qū)內(nèi)不同的家禽養(yǎng)殖場，通過K-B紙片擴(kuò)散法對22株臨床菌種進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示，臨床大腸桿菌菌株對多黏菌素B最為敏感。而反觀察其他藥物對22株臨床菌種的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，同一種藥物對不同大腸桿菌菌株會出現(xiàn)較大的差異，如大觀霉素對22株菌株的抑菌效果分別為[14.50±3.77(6) R]、[18.71±5.22(7) S]、[15.50±4.77(8) I]，同時出現(xiàn)3種不同判定結(jié)果且標(biāo)準(zhǔn)差均較大，該結(jié)果表明，同一地區(qū)不同養(yǎng)殖場間的同一菌株的優(yōu)勢血清型也不盡相同。

本試驗通過查閱了相關(guān)的著作和文獻(xiàn)[17-20]，選擇了金銀花和黃連等14 種有顯著抑菌效果的中藥對22株臨床大腸桿菌進(jìn)行了體外抑菌試驗，重點就14種中藥對受試菌的抑菌效果和抑菌譜的差異進(jìn)行了比較和分析，希望能對臨床用藥提供一些參考。所選的14種中藥進(jìn)行體外抑菌試驗結(jié)果表明，對于分離的22種大腸桿菌的臨床致病菌而言，14種中藥中僅白頭翁、金銀花、五倍子、秦皮、黃連、大青葉6種具有良好的抑制效果，該結(jié)果與現(xiàn)有報道有一定的差異性。本試驗中發(fā)現(xiàn)大黃對臨床大腸桿菌無抑制效果，其結(jié)果與竇志良[21]所報道的大黃對大腸桿菌無作用結(jié)論一致，而與姬志偉等[22]發(fā)現(xiàn)大黃對大腸桿菌具有顯著的抑制作用這一結(jié)論相矛盾。究其原因應(yīng)與試驗藥物基源、提取藥物的方法、菌株濃度以及藥物濃度具有相關(guān)性。另外，不同地區(qū)不同年份間的菌種之間的優(yōu)勢血清具有一定差異性，同時細(xì)菌具有較為復(fù)雜的耐藥機(jī)理，對于中藥中的揮發(fā)油、鞣質(zhì)、甙類以及生物堿等有效抑菌成分是否具有類似于抗菌藥的耐藥性[23-24]，尚需深入研究。

現(xiàn)有研究報道中細(xì)菌較少對中藥產(chǎn)生耐藥性，這一特性為解決細(xì)菌耐藥問題提供了新的思路，本試驗中所篩選出的白頭翁、金銀花、五倍子、秦皮、黃連、大青葉6種中藥也僅針對廣東地區(qū)家禽大腸桿菌疾病的臨床用藥有一定的參考價值，其是否適用于其他地區(qū)家禽大腸桿菌疾病臨床用藥還需進(jìn)一步探討。同時，本試驗結(jié)果也提示了摸清細(xì)菌性疾病與病毒性疾病的流行性是新藥篩選工作的重中之中。