豬源大腸桿菌黏附素相關(guān)基因檢測(cè)和耐藥性分析

馮茜茜 ， 陳 革 ， 張清一 ， 王鵬勇 ， 楊躍飛 ， 王彥紅

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009 ； 2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心 ， 江蘇 揚(yáng)州 225009)

大腸桿菌(Escherichiacoil,E.coli)是人和動(dòng)物腸道內(nèi)常見(jiàn)菌之一，正常情況下為非致病性共生菌，在特殊條件下會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌病的發(fā)生[1]。致病性大腸桿菌會(huì)引起仔豬黃痢、白痢、豬水腫和敗血癥等疾病。有些豬源致病性大腸桿菌具有一些黏附素相關(guān)毒力基因(如fimH和pap)，能增加尿路感染的機(jī)會(huì)，稱(chēng)為尿路致病性大腸桿菌(UropathogenicEscherichiacoil，UPEC)，這些菌株可能引起人致病，是潛在的人獸共患病病原。能夠促使UPEC入侵尿道細(xì)胞的重要毒力因子是黏附素，主要包括I型菌毛、P型菌毛、S型菌毛和FIC型菌毛。Ⅰ型菌毛由1個(gè)操縱子編碼，包括fimB、fimE、fimA、fimI、fimC、fimD、fimF、fimG和fimH共9個(gè)基因；P型菌毛由pap操縱子編碼，存在papA、papC、papGalleleⅠ、papGalleleⅢ等基因；FIC型菌毛由focA和focG等基因編碼；S型菌毛基因由sfaS等基因編碼。UPEC表達(dá)黏附素(如I型和P型菌毛)使細(xì)菌易于結(jié)合并侵入尿道內(nèi)的宿主細(xì)胞和組織[3]。

大腸桿菌感染是豬生產(chǎn)中重要疾病之一，能引起重大的經(jīng)濟(jì)損失，隨著我國(guó)養(yǎng)豬規(guī)模化工業(yè)化的發(fā)展，豬場(chǎng)大腸桿菌的暴發(fā)呈上升趨勢(shì)。人和豬分離的大腸桿菌菌株之間的相似性表明，大腸桿菌存在不同宿主之間交叉感染的可能性[4]。因此，本試驗(yàn)選擇8種黏附素相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，以期探討本地區(qū)豬源大腸桿菌黏附素部分毒力基因的攜帶情況，同時(shí)進(jìn)行耐藥性分析，為豬大腸桿菌病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 以本課題組2017年7—12月從揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院就診的病死豬脾、肝等組織作為病料。

1.2 主要試劑與儀器 瓊脂粉、氯化鈉，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麥康凱瓊脂粉，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；生化鑒定管和藥敏試紙片，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；PCR試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

超凈工作臺(tái)(型號(hào)為SW-CJ-IL)，購(gòu)自蘇州凈化工作臺(tái)設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)為GNP9080)，購(gòu)自上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；DNA擴(kuò)增儀(型號(hào)為4484073)，購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；凝膠電泳儀(型號(hào)為DYCP-31DN)，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌分離鑒定 將采集的樣品無(wú)菌操作接種于麥康凱平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取典型的單菌落再純化分離。挑取麥康凱瓊脂上粉紅色單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，觀察細(xì)菌的形態(tài)及生物學(xué)特性。將純化的細(xì)菌進(jìn)一步進(jìn)行生化鑒定。

1.4 藥敏試驗(yàn) 通過(guò)Kirby-Bauer(K-B)紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定15種抗菌藥物的耐藥性，無(wú)菌操作將25株分離菌的純培養(yǎng)物均勻涂抹于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Insitute,CLSI)(2009年)標(biāo)準(zhǔn)判定其耐藥性。

1.5 提取DNA 采用煮沸裂解法提取細(xì)菌的DNA。大腸桿菌分離株在血平板上純培養(yǎng)，挑取適量細(xì)菌，混入2 mL離心管中，充分混合均勻。離心管放入沸水中煮沸10 min，取出。冷卻至室溫后，放入-20 ℃保存，備用。

1.6 大腸桿菌黏附素相關(guān)基因檢測(cè) 利用PCR技術(shù)對(duì)黏附素相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，待檢測(cè)基因有Ⅰ型菌毛相關(guān)基因fimH，P型菌毛相關(guān)基因papA、papC、papGalleleⅠ、papGalleleⅢ，F(xiàn)IC型菌毛基因focA、focG，S型菌毛基因sfaS。相關(guān)基因引物根據(jù)參考文獻(xiàn)[5-8]合成(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 大腸桿菌黏附素相關(guān)基因PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR amplification primer targeting Escherichia coli adhesion-related genes

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定 2017年7—12月，采集25份病死豬樣品，其中7份脾臟、12份肝臟和5份心臟以及1份肺臟組織作為病料。經(jīng)細(xì)菌分離，在麥康凱培養(yǎng)基上形成中等大小、表面光滑、邊緣整齊的紅色菌落。生化鑒定結(jié)果顯示，25株分離得到的菌株均能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、果糖，少數(shù)能發(fā)酵蔗糖，并且都不能夠使甘露糖發(fā)酵；吲哚試驗(yàn)為陽(yáng)性，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)均為陰性，均符合大腸桿菌的生化特性。

2.2 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表2，25株豬源大腸桿菌對(duì)多西環(huán)素、卡那霉素、復(fù)方新諾明、氟苯尼考等10種藥物有較強(qiáng)的耐藥性，對(duì)丁胺卡那敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity testing results

2.3 大腸桿菌黏附素相關(guān)基因檢測(cè) PCR擴(kuò)增后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物，將目的片段送至南京金瑞斯生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果上傳GenBank進(jìn)行序列比對(duì)，基因確認(rèn)后的菌株作為陽(yáng)性對(duì)照。25株菌黏附素相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果顯示，部分菌株檢測(cè)出fimH、papC和focG基因，檢測(cè)率分別為40%、8%和4%，papA、papGalleleⅠ、papGalleleⅢ、focA、sfaS基因均未被檢測(cè)出。部分基因的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1～3。同時(shí)攜帶fimH和papC基因的僅有1株。

圖1 fimH基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of fimH geneM：100 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～8：樣品； 9：陽(yáng)性對(duì)照； 10：陰性對(duì)照M:100 bp DNA marker; 1-8:Samples; 9:Positive control; 10:Negative control

3 討論

本試驗(yàn)共分離出25株豬源大腸桿菌，對(duì)15種臨床常用藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，從臨床病例分離的大腸桿菌耐藥比較嚴(yán)重，多西環(huán)素耐藥率最高，多西環(huán)素抗菌譜廣，養(yǎng)殖過(guò)程中大量使用此類(lèi)藥物用于預(yù)防和治療疾病，是導(dǎo)致耐藥的一種原因，另一種原因可能是耐藥基因的水平傳播。除多西環(huán)素外，25株菌對(duì)喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)、氯霉素類(lèi)抗菌藥耐藥，對(duì)美洛西林、環(huán)丙沙星、鏈霉素的耐藥率也超過(guò)50%，此耐藥情況與國(guó)內(nèi)其他大腸桿菌耐藥情況類(lèi)似[9]。

圖2 focG基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of focG geneM：100 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1：陰性對(duì)照； 2：陽(yáng)性對(duì)照； 3～19：樣品M:100 bp DNA marker; 1:Negative control; 2:Positive control; 3-19:Samples

圖3 papC基因的PCR擴(kuò)增Fig.3 PCR amplification of papC geneM：100 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～13：樣品； 14：陽(yáng)性對(duì)照； 15：陰性對(duì)照M:100 bp DNA marker; 1-13:Samples; 14:Positive control; 15:Negative control

25株菌檢測(cè)8種黏附素相關(guān)基因結(jié)果顯示，菌株攜帶fimH、papC和focG基因，攜帶率分別為40%、8%和4%，此外，僅1株細(xì)菌同時(shí)攜帶fimH和papC。UPEC致病的第1步是定植到宿主細(xì)胞上，黏附素的表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)菌的毒力。較多的腸外致病性大腸桿菌攜帶有Ⅰ型菌毛基因fimH，Ⅰ型菌毛是腸外大腸桿菌進(jìn)行黏附的重要毒力基因，fimH蛋白能夠暴露于細(xì)菌表面，介導(dǎo)與D-甘露糖受體的特異性結(jié)合[10]?？少x予Ⅰ型菌毛結(jié)合D-甘露糖，并結(jié)合許多類(lèi)型的真核細(xì)胞(包括腸、肺、膀胱、腎上皮和各種炎癥細(xì)胞)的能力對(duì)保護(hù)大腸桿菌免受吞噬有直接或間接的作用[11]。P型菌毛主要由pap(Pyelonephritis-associated pili)基因簇表達(dá)蛋白共同組裝構(gòu)成，介導(dǎo)尿道致病性大腸桿菌的黏附定植，與動(dòng)物的泌尿道感染有著密切關(guān)系。在UPEC的流行病學(xué)中發(fā)現(xiàn)，70%的腎盂腎炎病例表達(dá)P菌毛，膀胱炎病例和無(wú)癥狀尿道感染分離的UPEC分別有36%、24%菌株攜帶該菌毛。FIC菌毛foc和S菌毛sfa這2種黏附素具有高度同源性，F(xiàn)IC型菌毛主要黏附遠(yuǎn)端小管和集合管上皮細(xì)胞。Zhu等[12]對(duì)豬源大腸桿菌毒力基因研究發(fā)現(xiàn)fimH、papC、papA、sfaS基因的檢測(cè)率分別為81.3%、21.9%、4.7%和1.6%。Tan等[13]的研究顯示，fimH基因在豬分離株中檢出率高達(dá)85.4%。Khan等[14]的研究中fimH、sfaS、focG基因的檢出率均在50%以上，papA、papC基因的檢出率均在40%以上。通過(guò)上述研究可知，較多豬源大腸桿菌與UPEC具有相似的黏附素相關(guān)基因，是一種潛在的人獸共患病病原，加強(qiáng)豬大腸桿菌感染的防控具有一定的公共衛(wèi)生安全意義。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，從動(dòng)物醫(yī)院臨床病料中分離得到的豬源大腸桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)和磺胺類(lèi)藥物的耐藥性比較嚴(yán)重，盡管分離到的腸外致病性大腸桿菌攜帶有Ⅰ型菌毛基因(fimH)、P型菌毛基因(papC)以及FIC菌毛基因(focG)，與尿路致病有著密切關(guān)系，但菌株的毒力與基因型之間的關(guān)系以及尿道致病機(jī)制無(wú)法確定，還需進(jìn)一步研究。