米根霉發酵對脫脂薏米麩皮營養組成及抗氧化活性的影響

徐 磊 高 珊 王 心 許 歡 侯 陽 王曉樂 陳曉明

(淮陰工學院生命科學與食品工程學院，淮安 223003)

薏米屬禾本科，又名薏苡仁、六谷米等，是一種典型的藥食兩用資源，其加工利用價值較高，具有“世界禾本科植物之王”的美譽。薏米麩皮是薏米精白過程的主要副產物，約占糙薏米質量的8%，含有豐富的蛋白質、纖維素、脂肪和礦物質等營養成分，同時富含薏苡素、生育酚、多酚等多種天然生物活性成分[1]。薏米麩皮中的功能性成分具有抗發炎鎮痛[2]、治療高尿酸血癥[3]等多種生理活性。我國是薏米種植和消費大國，具有較為完整的薏米產業鏈，然而目前我國薏米麩皮利用率仍較低，主要用作動物飼料或者直接被拋棄，造成了薏米資源的嚴重浪費。探尋薏米麩皮的高值轉化利用技術成為薏米加工企業和科研工作者面臨的重要問題。

微生物發酵作為一種典型的食品加工技術，已被廣泛用于各種谷物及其副產物的開發利用中，不僅可改善谷物質地和賦予新的風味，還可以增強其生理活性。Yin等[4]研究表明植物乳桿菌發酵薏米可以顯著提高其游離氨基酸、可溶性膳食纖維及有機酸含量，同時還可改善薏米漿的風味和穩定性。劉磊等[5]利用復合乳酸菌對脫脂米糠進行半固態發酵，發現發酵可提高可溶性膳食纖維和總酚含量，同時還可以提高米糠提取物中必需氨基酸和非必需氨基酸比值。Shin等[6]研究發現黑米麩皮經泡盛曲霉和米曲霉固態發酵后，乙醇提取液的酚酸含量、自由基清除活力和酪氨酸酶抑制活性顯著提高。

米根霉具有發達的淀粉和蛋白酶系，是藥和酒曲中的優勢菌種，在我國傳統發酵中扮演著重要角色[7]。目前關于米根霉發酵對薏米麩皮營養組成和抗氧化活性的影響鮮有報道。本研究以脫脂薏米麩皮為原料，采用米根霉發酵脫脂薏米麩皮，分析了發酵過程中游離氨基酸、多肽、多酚、黃酮、酚類物質組成及抗氧化活性的變化，旨在為基于薏米麩皮功能性產品的開發以及拓寬薏米麩皮的加工途徑提供新思路和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

米根霉(1010CFU/g)；乙腈：色譜純；6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox)、2,2'-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)等均為分析純。

脫脂薏米麩皮：實驗室自制。新鮮薏米麩皮購自福建省浦城縣官路神農薏米專業合作社，經正己烷脫脂，40 ℃烘干，粉碎過80目篩后備用。

1.1.2 實驗儀器

ZQLY-180S振蕩培養箱,TGL20M冷凍離心機,SCIENTZ-10N冷凍干燥機,Agilent 1100及Agilent 1260氨基酸專用高效液相色譜儀,LC-2030液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 發酵脫脂薏米麩皮的制備

準確稱取30 g脫脂薏米麩皮和0.3 g米根霉于100 mL燒杯，加入45 mL蒸餾水攪拌混勻。然后置于37 ℃恒溫培養箱中，分別發酵0、12、24、48、72 h，取樣冷凍干燥，磨粉過80目篩，-20 ℃貯存備用。

1.2.2 pH、可滴定酸和還原糖含量測定

參考崔晨曉等[8]的方法測定pH和可滴定酸。準確稱取5 g發酵脫脂薏米麩皮，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL去離子水，室溫磁力攪拌30 min后直接測定pH。采用0.1 mol/L NaOH溶液滴定懸浮液使pH值至8.5，記錄消耗的NaOH溶液體積，可滴定酸以每克樣品所消耗的NaOH溶液表示(mL/g)。

制備的發酵薏米麩皮懸浮液4 000 r/min離心10 min，收集上清液，然后采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量，結果以每克樣品含葡萄糖表示(mg/g)。

1.2.3 游離氨基酸分析

參考GB/T 18246—2019《飼料中氨基酸的測定》的方法，使用安捷倫氨基酸自動分析儀對發酵薏米麩皮中的18種游離氨基酸進行分析。

1.2.4 多肽分子量分布測定

參考Zhao等[9]的方法進行多肽分子量分布分析。HPLC系統選用TSK gel G2000 SWXL凝膠柱(300 mm×7.8 mm)；流動相為10%乙腈(含0.1%TFA)；柱溫為30 ℃；檢測器波長為220 nm；流速為0.5 mL/min。準確稱取0.4 g發酵脫脂薏米麩皮溶于4 mL流動相，室溫振蕩提取2 h，10 000 r/min離心20 min后收集上清液。上清液經0.45 μm的微孔濾膜過濾后進行HPLC分析，進樣量為20 μL。

1.2.5 游離型、結合型酚類物質的提取

參考Zhao等[3]的方法提取游離型、結合型酚類物質。準確稱取1 g發酵脫脂薏米麩皮，加入20 mL預冷的酸化甲醇溶液(甲醇∶去離子水∶濃鹽酸=64∶15∶1)，室溫下振蕩提取2 h，然后4 000 r/min離心15 min收集上清液。離心所得殘渣在相同條件下再重復提取兩次。合并3次離心所得上清液，在45 ℃下旋蒸至干燥，所得殘余用甲醇重新定容到10 mL，此即為游離型酚類物質提取液，貯存于-40 ℃冰箱待用。

將上述游離型酚類物質提取后的殘渣收集于100 mL錐形瓶中，加入2 mol/L NaOH溶液20 mL，并充氮密封，于室溫下振蕩水解2 h，接著用6 mol/L HCl調整pH值至2.0。然后用20 mL乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液，40 ℃旋轉蒸發至干燥，殘留物用甲醇定容到10 mL，得結合型酚類物質提取液，于-40 ℃冰箱儲存備用。

1.2.6 總酚、總黃酮含量測定

1.2.6.1 總酚含量

采用福林酚法測定總酚含量[3]。取0.2 mL稀釋1倍的酚類物質提取液至離心管中，加入1.3 mL去離子水和0.25 mL福林酚試劑，充分混勻后靜置6 min，再加入0.75 mL 20% Na2CO3溶液和2.5 mL去離子水，漩渦混勻后于40 ℃水浴避光孵育2 h，于760 nm波長下測定吸光值。同時以0.2 mL甲醇代替提取液作空白對照，以沒食子酸標準品繪制標準曲線。總酚含量以每100 g干基(DW)所對應的沒食子酸(GAE)當量表示(mg GAE/100 g DW)。

1.2.6.2 總黃酮含量

參考Amir等[10]的方法測定總黃酮含量。取0.5 mL稀釋1倍的酚類物質提取液，加入2 mL 30%乙醇溶液和0.15 mL 5% NaNO2，充分混勻后反應6 min。然后加入0.15 mL 10% Al(NO3)3·6H2O溶液，混勻后靜置 6 min。最后加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液和0.2 mL去離子水，混勻后室溫避光孵育15 min，于510 nm波長下測定其吸光值。同時以0.5 mL甲醇代替樣品作空白對照，以蘆丁標準品制作標準曲線。總黃酮含量以每100 g干基所對應的蘆丁(RE)當量表示(mg RE/100 g DW)。

1.2.7 酚類物質組成測定

參照Chen等[11]的方法，采用LC-2030液相色譜儀對酚類物質提取液中的酚類物質進行定性和定量分析。選用SunFire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫設置為35 ℃；檢測器波長為280 nm；流速為0.9 mL/min。采用梯度洗脫，流動相A和B分別為水(含0.1%乙酸)和甲醇(含0.1%乙酸)。各樣品過0.45 μm的微孔濾膜后進行HPLC分析，進樣量為20 μL，結果以每克干重脫脂薏米麩皮所含有的化合物含量表示(μg/g DW)。

1.2.8 抗氧化活性測定

1.2.8.1 ABTS+·清除能力

參考Erel等[12]的方法測定ABTS+·清除能力。取0.1 mL多酚提取液，加入3.9 mL 新鮮配制的ABTS+·工作液，混勻后在25 ℃下避光反應15 min，測定734 nm處吸光值。同時以0.1 mL甲醇代替樣品作為空白對照，以Trolox標準品繪制標準曲線。ABTS+·清除能力以每克干基所對應的Trolox當量表示(μmol TE/g DW)。

1.2.8.2 鐵離子還原能力(FRAP)

參考Benzie等[13]的方法測定FRAP。取2.7 mL新鮮配制的FRAP試劑，分別加入90 μL酚類物質提取液和270 μL去離子水，振蕩混勻后于室溫避光處反應30 min，測定593 nm下吸光值。同時以90 μL甲醇代替提取液作空白對照，用Trolox標準品繪制標準曲線。FRAP以每克干基所對應的Trolox當量表示(μmol TE/g DW)。

1.3 數據統計與分析

所有實驗均重復測定3次，結果表示為平均值±標準偏差。采用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行Duncan’s多重比較(P<0.05表示差異顯著)，使用Origin 9.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵對pH、可滴定酸及還原糖含量的影響

脫脂薏米麩皮發酵過程中pH、可滴定酸和還原糖含量的變化與米根霉生長繁殖過程中代謝產物的積累具有密切關系。由表1可知，隨著發酵時間的延長，脫脂薏米麩皮的pH呈逐漸降低的趨勢，而可滴定酸呈逐漸增加的趨勢。張杰等[14]報道黑青稞在米根霉發酵后，pH顯著降低，而總酸含量顯著提高，這與本研究結果一致。發酵12 h后，脫脂薏米麩皮還原糖含量顯著增加，而后隨著發酵時間的延長還原糖含量逐漸降低，72 h后還原糖含量僅為未發酵脫脂薏米麩皮的51.9%。

表1 脫脂薏米麩皮發酵過程中pH、可滴定酸和還原糖含量的變化

2.2 發酵對游離氨基酸含量的影響

微生物發酵谷物過程中可利用其自身蛋白酶系降解谷物蛋白生成氨基酸，一部分作為氮源供給自身代謝，另一部分則作為游離氨基酸存在于谷物中[14]。脫脂薏米麩皮發酵過程中游離氨基酸含量的變化如表2所示。發酵過程中總游離氨基酸含量顯著增加，從發酵初期至發酵結束增加了近9倍。發酵72 h后，必需氨基酸的含量從0.88 mg/g增加到13.43 mg/g，非必需氨基酸的含量從2.27 mg/g增加到18.32 mg/g，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值從0.39增加到0.73。發酵過程中，除了絲氨酸、精氨酸、酪氨酸和賴氨酸，其他游離氨基酸都隨著發酵時間的延長含量呈緩慢上升趨勢；必需氨基酸中，亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸含量變化最為明顯，發酵72 h后分別增加了2.82、2.52、1.93 mg/g；而非必需氨基酸中，谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸含量變化最為明顯，發酵72 h后分別增加了5.89、3.10、2.31 mg/g。γ-氨基丁酸是一種谷物中廣泛存在的四碳非蛋白質氨基酸，對人體健康具有很多益處[15]。脫脂薏米麩皮發酵初期γ-氨基丁酸含量為0.22 mg/g，隨著發酵時間的延長含量逐漸增加，72 h后增長了2.7倍。Kim等[16]在大米麩皮孵育過程中也報道了顯著增長的γ-氨基丁酸含量。

表2 脫脂薏米麩皮發酵過程中游離氨基酸含量的變化/mg/g

2.3 發酵對多肽分子量分布的影響

多肽是一種重要的功能性物質，據報道來源于薏米蛋白的多肽具有治療扁平疣、腫瘤等疾病的功效[17]。表3為脫脂薏米麩皮發酵過程中多肽分子量分布的分析。脫脂薏米麩皮發酵過程中，48.63%～54.77%的多肽分子量小于180 u，22.37%～27.02%的多肽分子量位于500～180 u，表明脫脂薏米麩皮中的多肽主要是一些三肽、二肽及氨基酸。脫脂薏米麩皮發酵過程中分子質量位于15 000～1 000 u的多肽比例隨發酵時間的延長逐漸降低，而分子質量低于500 u的多肽比例隨著發酵時間的延長逐漸增加。分子質量位于1 000～500 u的多肽比例在發酵12 h后顯著降低，12～48 h之間呈逐漸增加的趨勢，而后又顯著降低。與本研究結果一致，Liu等[18]在脫脂小麥胚芽發酵過程中也報道了顯著增加的小分子多肽含量和顯著降低的大分子多肽含量。小分子多肽具有更高的功能活性[19]，脫脂薏米麩皮發酵過程中顯著增加的小分子多肽比例可顯著提高其生物活性。

表3 脫脂薏米麩皮發酵過程中多肽分子量分布的變化

2.4 發酵對多酚和黃酮含量的影響

酚類物質是一種廣泛存在于植物體中的重要次生代謝產物，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性。根據酚類物質與植物細胞中其他組分結合的緊密程度可將酚類物質分為游離型和結合型。脫脂薏米發酵過程中不同結合形態多酚和黃酮含量的變化如圖1所示。未發酵脫脂薏米中游離型、結合型和總多酚含量分別為245.67、273.11、518.78 mg GAE/100 g DW。隨著發酵時間的延長游離型和總多酚含量逐漸增加，發酵72 h后分別增長了111.7%和53.2%，而結合型多酚含量在發酵過程中未發生顯著變化(P>0.05)。脫脂薏米麩皮中的黃酮主要以游離態的形式存在，未發酵脫脂薏米中游離型、結合型和總黃酮含量分別為184.45、69.62、254.06 mg RE/100 g DW。隨著發酵時間的延長，游離型和總黃酮含量逐漸增加，發酵72 h后分別增長了168.6%和121.9%，而結合型黃酮含量在發酵過程中保持不變。Shumoy等[20]報道tefinjera在發酵過程中游離型、結合型多酚和黃酮含量隨著發酵時間顯著提高。冉玉兵等[21]在研究乳酸菌發酵龍眼果漿時發現，發酵可顯著提高游離型多酚含量而對結合多酚含量無影響。微生物代謝過程中產生的各種酶可水解植物細胞壁促進酚類物質釋放，但不同植物細胞壁在組成和結構方面存在顯著差異也導致發酵過程中游離型、結合型酚類物質變化的不一致。

注：同一指標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，余同。圖1 脫脂薏米麩皮發酵過程中不同形態多酚和黃酮含量的變化

2.5 發酵對酚酸組成的影響

脫脂薏米麩皮發酵過程中酚酸組成及含量變化見表4。脫脂薏米麩皮發酵過程中共檢出8種游離型酚酸和4種結合型酚酸，各酚酸含量隨發酵時間發生顯著變化。脫脂薏米麩皮中的3,4-二羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸和丁香酸以游離態的形式存在，隨著發酵時間的延長含量逐漸升高，發酵72 h后分別增長了3.4、3.2、7.9倍。咖啡酸也以游離態的形式存在，發酵初期其含量從18.4 μg/g DW增加到38.0 μg/g DW，而后隨著發酵時間的延長逐漸降低，發酵72 h后為10.0 μg/g DW。脫脂薏米麩皮發酵過程中，游離型和結合型的綠原酸含量隨著發酵時間的延長都呈逐漸增加的趨勢。脫脂薏米麩皮中游離型和結合型齊墩果酸含量隨著發酵時間的延長均顯著增加(P<0.05)，發酵72 h分別增長了3.0、0.6倍。脫脂薏米麩皮中游離型香豆酸主要以結合態形式存在，發酵過程中游離型香豆酸逐漸降低，而結合型香豆酸在發酵前24 h逐漸增加，之后含量逐漸降低，總香豆酸含量變化與結合型香豆酸變化基本一致。阿魏酸也主要以結合態形式存在，發酵過程中結合態和總阿魏酸含量分別降低了20.2%和16.6%，而游離型阿魏酸含量增長了78%。發酵過程中的生物學作用可促進結合態酚類物質的釋放，提高游離態多酚含量，同時酚類物質也可發送生物轉化作用變成其他物質導致其含量降低[22]。

表4 脫脂薏米麩皮發酵過程中游離型、結合型和總酚酸含量的變化/μg/g DW

2.6 發酵對抗氧化活性的影響

谷物中的酚類物質可通過提供電子、氫原子或者鰲合金屬離子的方法淬滅和清除自由基，因此具有較高的抗氧化活性[23]。本研究采用FRAP和ABTS+·清除能力表征脫脂薏米發酵過程中酚類提取物的抗氧化活力，結果如圖2所示。脫脂薏米發酵過程中，隨著發酵時間的延長游離型和總酚類物質提取物的FRAP逐漸增加，發酵72 h后分別增長了119.6%和60.5%，而結合型多酚含量在發酵過程中保持不變(P>0.05)。在發酵過程中，脫脂薏米的游離型和總酚類物質提取物的ABTS+·清除能力隨著發酵時間的延長顯著上升(P<0.05)，在72 h相較于未發酵脫脂薏米分別增長了52.1%和25.9%，而結合型酚類物質提取物的ABTS+·清除能力在整個發酵過程中未發生顯著變化(P>0.05)。Gan等[24]也報道了可食用豆類發酵過程中可顯著提高游離型酚類物質提取物的抗氧化活力。

圖2 脫脂薏米麩皮發酵過程中不同形態多酚提取物的FRAP和ABTS+·清除能力的變化

3 結論

以脫脂薏米麩皮為原料，考察了米根霉發酵對其營養組成及抗氧化活性的影響。脫脂薏米麩皮經米根霉發酵后pH顯著下降、可滴定酸顯著提高(P<0.05)，而還原糖含量呈先上升后下降的趨勢。在發酵過程中，脫脂薏米麩皮的總游離氨基酸增加了近9倍，小分子多肽(分子質量小于500 u)比例隨著發酵時間延長逐漸提高。米根霉發酵顯著提高了脫脂薏米麩皮的游離型多酚和黃酮含量(P<0.05)，但對結合型多酚和黃酮含量無顯著影響(P>0.05)。脫脂薏米麩皮發酵過程中共檢出8種游離型酚酸和4種結合型酚酸，發酵處理提高了大部分游離型酚酸含量。此外，發酵處理后脫脂薏米麩皮的游離型酚類提取物的抗氧化活力顯著提高(P<0.05)，而對結合型酚類提取物的抗氧化活力無顯著性影響(P>0.05)。該研究可為薏米麩皮的加工利用提供新思路和技術指導。