綠豆發(fā)芽過程中多酚組成及抗氧化活性的變化

魏美霞 梁雪梅 林欣梅 曹龍奎 李志江,3,4 鹿保鑫,4

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319) (國家雜糧工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319) (黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實驗室3，大慶 163319) (黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心4，大慶 163319)

綠豆，又名青小豆、植豆等，是我國傳統(tǒng)農(nóng)作物之一。近些年來，由于人們飲食觀念的改變和對營養(yǎng)健康生活的追求，綠豆及其芽苗產(chǎn)物因其具備豐富的營養(yǎng)價值得到了更加廣泛的關(guān)注[1]。綠豆在含有大量營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)[2-4]的同時也存在一些抗?fàn)I養(yǎng)化合物，如植酸、單寧、蛋白酶抑制劑等，這些抗?fàn)I養(yǎng)化合物的存在限制了綠豆中碳水化合物、蛋白質(zhì)、微量元素等在機(jī)體的生物利用度[5]。有大量研究表明綠豆在進(jìn)行發(fā)芽處理后，綠豆中抗?fàn)I養(yǎng)成分的含量明顯減少，并且與未發(fā)芽綠豆相比其營養(yǎng)價值水平又有顯著的提高[6]，尤其是酚類[7]和膳食纖維類[8]化合物。López等[9]通過研究發(fā)芽對豆類酚類物質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)芽后酚類化合物含量及抗氧化能力均有提高。Cevallos等[8]分析研究綠豆、蠶豆等13種可食種子在萌芽過程中酚類物質(zhì)含量及活性的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)芽后各個種子活性物質(zhì)及抗氧化活性有不同程度的增加。

綠豆芽與人們的日常飲食密切相關(guān)，確定綠豆芽發(fā)芽時期以獲取高活性多酚化合物在日常生活和工業(yè)生產(chǎn)中都十分重要，但是目前對綠豆芽多酚化合物的研究還比較籠統(tǒng)和模糊，綠豆在發(fā)芽過程中多酚活性物質(zhì)是如何變化的尚不清楚。因此本實驗以未發(fā)芽綠豆、綠豆芽長0～1、1～2、2～3、3～4、4～5、5～6 cm及6 cm以上的8個時期綠豆芽為原料，考察綠豆在發(fā)芽過程中多酚化合物組成及抗氧化活性的變化，從而確定富含活性多酚化合物的綠豆發(fā)芽時期，為以后綠豆芽在多酚活性物質(zhì)上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

綠豆：顆粒飽滿均勻，色澤深綠，無破損的山西大同小明綠豆。

福林酚試劑、沒食子酸、DPPH(標(biāo)準(zhǔn)品)、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒、AB-8型大孔樹脂；甲醇、乙腈、醋酸銨、甲酸為LC-MS級；無水乙醇、Na2CO3、FeSO4、水楊酸等均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

YB-1000A型高速多功能粉碎機(jī)，CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀，TDZ5-WS型低速自動平衡離心機(jī)，RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-(Ⅲ)A多功能循環(huán)水式真空泵，真空冷凍干燥機(jī)，Beta2-8LD plus真空冷凍干燥機(jī)，TU-1810型紫外可見分光光度計，MD200-2氮吹儀，Thermo Vanquish UHPLC超高效液相色譜，Q-Exactive HF高分辨質(zhì)譜，Zorbax Eclipse Sepax HP-C18 C18(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)色譜柱。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理

綠豆經(jīng)除雜漂洗3～4遍后平鋪于綠豆芽機(jī)中進(jìn)行發(fā)芽處理，設(shè)置溫度為25 ℃，每隔2～3 h自動淋水，分別量取未發(fā)芽綠豆與發(fā)芽芽長為0～1、1～2、2～3、3～4、4～5、5～6 cm及6 cm以上時的綠豆芽于45 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干，經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎后過80目篩制成綠豆芽粉，真空包裝后于0～4 ℃冰箱存儲備用。

1.2.2 綠豆芽多酚的提取

根據(jù)Zhang等[10]方法稍作修改，準(zhǔn)確稱取2.0 g綠豆芽粉于燒杯中，以1∶30的料液比加入60 mL 60%的乙醇溶液，混勻后置于超聲-微波萃取儀中，設(shè)置超聲時間1 000 s、超聲溫度35 ℃、超聲功率400 W，萃取結(jié)束后取出置于離心機(jī)中，在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min下離心10 min，收集上清溶液。向沉淀物中再次加入60 mL 70%乙醇水溶液，重復(fù)上述步驟，合并兩上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在45 ℃條件下旋至無水狀態(tài)，殘余物用70%甲醇洗出定容至10 mL，得待測綠豆芽多酚提取液，分裝后凍存于-20 ℃的冰箱中備用(實驗前利用氮吹儀除去甲醇)。

1.2.3 綠豆芽多酚含量的測定

根據(jù)Folin-Ciocalteu法稍作修改[11]，得線性方程為y=0.117 7x+0.004 8，R2=0.999 8，線性關(guān)系良好。多酚含量測定結(jié)果以干基1 g綠豆芽粉樣品中所含沒食子酸當(dāng)量(mg gallic acid equivalents/g dry weight)表示，簡寫為mg GAE/g DW。

1.2.4 綠豆芽發(fā)芽過程中多酚抗氧化活性的檢測

1.2.4.1 DPPH清除能力的測定

根據(jù)Nevcihan等[12]方法稍作修改，以無水乙醇作為對照，平行3次實驗。

式中：A0為空白組的吸光度值；A1為樣液測定組的吸光度值；A2為乙醇對照組的吸光度值。

1.2.4.2 總抗氧化能力(T-AOC)的測定

利用南京建成總抗氧化(T-AOC)試劑盒測定，根據(jù)其說明書平行3次實驗，于520 nm處測定吸光值。

式中：OD測量為待測樣品吸光值；OD對照為對照樣品吸光值；V反為反應(yīng)液重量；V取為取樣量。

1.2.4.3 羥自由基清除能力的測定

根據(jù)水楊酸法結(jié)合實際稍作修改[13]，配制9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，9 mmol/L FeSO4溶液，8.8 mmol/L H2O2溶液，按1 mL FeSO4，1 mL水楊酸-乙醇，0.3 mL樣液，0.7 mL水，1 mL H2O2的順序依次加入試管中，37 ℃水浴鍋中溫浴30 min，用水做空白對照，510 nm處測定吸光值，平行3次實驗。

式中：Ak為空白組的吸光度值；Am為樣液組的吸光度值；An為對照組的吸光度值。

1.2.5 綠豆芽多酚的分離純化

根據(jù)高云濤等[14]的方法稍作修改，選擇AB-8大孔樹脂對綠豆芽多酚提取液進(jìn)行分離純化。大孔樹脂經(jīng)無水乙醇浸泡24 h后，去離子水洗去乙醇至中性，浸泡在去離子水中備用。采用徑高比1∶13、PH為6、上樣質(zhì)量濃1.8 mg/mL、流速3.0 BV/h的純化條件進(jìn)行動態(tài)吸附。大孔樹脂吸附飽和平衡后，先用去離子水洗去柱內(nèi)雜質(zhì)，再用70%乙醇溶液以2.0 BV/h的流速進(jìn)行動態(tài)洗脫，收集純化后的綠豆芽多酚于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮處理。將純化后的綠豆芽多酚濃縮液在-24 ℃冰箱中預(yù)凍18 h后置于真空冷凍干燥機(jī)中，真空度0.1 kPa以下，冷阱溫度-55 ℃下干燥12 h，得到純化后綠豆芽多酚凍干粉末存儲于干燥器中備用。

1.2.6 綠豆芽發(fā)芽過程中多酚組成的鑒定分析

通過超高效液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS/MS)技術(shù)分離鑒定純化后綠豆芽多酚中的小分子化合物，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫信息注釋和分類，使用Compound Discoverer 3.0對其組分進(jìn)行定性分析[15-17]。

綠豆芽多酚樣液的制備：不同芽長綠豆芽多酚凍干粉，加入甲醇復(fù)溶，0.45 μm 微孔濾膜過濾，制成高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測的待測液。

超高效液質(zhì)分析條件：色譜柱：Zorbax Eclipse C18色譜柱 (1.8 μm·2.1·100 mm)，液相色譜條件：流動相A為0.1%甲酸，流動相B為100%乙腈，線性梯度洗脫條件為0～5 min，98 A/2B；5～20 min，2 A/98A；20～25 min，98 A/2B；25～30 min，98 A/2B。柱溫30 ℃，進(jìn)樣量2 μL，流速300 μL/min。質(zhì)譜條件：加熱器溫度300 ℃；鞘氣流速45 arb；輔助氣流速：15 arb；尾氣流速：1 arb；電噴霧電壓：3.0 kV；毛細(xì)管溫度：350 ℃；S-Lens RF Level, 30%。碰撞模式為高能量碰撞解離(HCD)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 17.0、Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和處理，顯著性分析采用 ANOVA 單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson 法線性回歸處理。實驗數(shù)據(jù)均為 3 次平行測定，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示，P<0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 芽長對綠豆芽多酚含量的影響

由圖1可知，各發(fā)芽時期綠豆芽多酚含量差異性顯著。綠豆在0～3 cm萌芽時期，其多酚含量較未發(fā)芽綠豆減少了7%～12%。在綠豆芽芽長為4～5 cm時，其多酚含量達(dá)到最高，較未發(fā)芽綠豆提高了38%。然而，隨著芽長的不斷生長，綠豆芽多酚的含量開始減少。這可能與綠豆芽及根中的多酚氧化酶的活性有關(guān)，綠豆在萌芽階段，活性較高的多酚氧化酶氧化一部分多酚化合物，因此，多酚含量較低，而隨著芽長的增長，多酚氧化酶活性降低，綠豆芽多酚含量開始升高[18]。而當(dāng)芽長增至6 cm及6 cm以上時，綠豆芽的多酚含量雖有所增加，但仍低于芽長為4～5 cm的綠豆，該結(jié)果與Huang等[19]得到的發(fā)芽初期芽長增長顯著，且在1～2 d(3～5 cm)時總酚含量增加明顯的結(jié)果相似，并且在發(fā)芽2 d(5 cm)時抗壞血酸含量最高。

注：不同小寫字母表示差異性顯著(P<0.05),余同。圖1 綠豆芽長對多酚含量的影響

2.2 發(fā)芽對綠豆多酚抗氧化活性的影響

由圖2可知，綠豆在發(fā)芽過程中多酚化合物對DPPH、羥自由基的清除能力和總抗氧化能力的變化趨勢整體相似。相比未發(fā)芽綠豆，在綠豆芽長0～1 cm 時多酚的抗氧化能力均顯著升高。結(jié)合圖1、表1、表2推測可能是由于芹菜素的出現(xiàn)，木犀草甘、野漆樹苷等黃酮化合物含量的增加；在芽長4～5 cm時，DPPH、羥自由基清除率及總抗氧化能力均達(dá)到最大值，綠豆芽多酚的DPPH清除率為93.82%，相比于未發(fā)芽綠豆提高了8.8%；羥自由基的清除率為93.90%，相比于未發(fā)芽綠豆提高了17.4%；總抗氧化能力為8.32 U/mg，相比于未發(fā)芽綠豆提高了34%。該結(jié)果可能是由于在此期間多酚的種類和含量均達(dá)到最大，多酚總濃度達(dá)到最高，是整個發(fā)芽過程中多酚化合物種類最豐富的時期，這結(jié)果分別與付曉燕等[20]在研究燕麥發(fā)芽過程中DPPH的清除能力結(jié)果，呂俊麗等[21]在研究莜麥發(fā)芽過程中羥自由基的變化結(jié)果及徐建國[22]研究燕麥發(fā)芽過程中多酚含量及其抗氧化活性的變化相近。

圖2 發(fā)芽對綠豆多酚抗氧化活性的影響

2.3 芽長對綠豆芽多酚組分的影響

本實驗共定性出 39種多酚化合物，包含28種黃酮類化合物，11種異黃酮類化合物，這與董銀卯等[23]敘述的萌芽綠豆中多酚組成結(jié)果相似。由表1、表2可知，綠豆在發(fā)芽后產(chǎn)生了4種新的異黃酮類化合物：豆苷、金雀異黃酮、補(bǔ)骨脂甲素和染料木苷，7種黃酮類化合物：芹菜素、白楊素、姜黃素、櫻花素、異懈皮苷、橙皮苷、夏佛塔苷。原有的多酚化合物隨著發(fā)芽周期的不同，其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)也發(fā)生了變化，不同芽長綠豆芽間多酚組成存在明顯差異，各發(fā)芽時期多酚化合物相對含量差異性顯著。

表1 不同綠豆芽長異黃酮的分布情況

表2 不同綠豆芽長黃酮類化合物的分布情況

綠豆發(fā)芽前后多酚化合物主要以牡荊素、大豆苷元、香豆雌酚、芹菜素等為主。除6 cm以上綠豆芽，其余時期的牡荊素的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著芽長的增長整體呈現(xiàn)下降趨勢，這與董銀卯等[23]對綠豆芽發(fā)芽過程中牡荊素含量變化的研究結(jié)果相似；大豆苷元是大豆異黃酮最主要的組成之一，對心血管疾病、腫瘤、癌癥、骨質(zhì)疏松癥、更年期綜合征、衰老等有極好的預(yù)防效果[24，25]，在發(fā)芽過程中其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著芽長的增長而顯著增加，這與周光明等[26]對綠豆芽發(fā)芽過程中大豆苷元的變化情況基本一致；香豆雌酚[27]屬于植物雌激素，具有雌激素活性。已有大量研究[28，29]表明其對結(jié)腸癌、子宮肌瘤、乳腺癌等具有很好的抑制作用，并且能夠預(yù)防女性絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松、生殖系統(tǒng)紊亂等疾病；綠豆在發(fā)芽后，芹菜素的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，分析可能是在萌芽過程中，綠豆為了合成次級代謝產(chǎn)物，需要通過糖苷中的小分子化合物提高能量，綠豆種子在吸收水分時，由于內(nèi)源性葡萄糖苷酶的存在，其原有的黃酮類化合物被水解成芹菜素后又被轉(zhuǎn)化為其他黃酮類化合物[30]。與董銀卯等[23]研究結(jié)果相似。芽長4～5 cm時多酚化合物達(dá)到33種，包含22種黃酮類化合物、11種異黃酮類化合物，是整個發(fā)芽過程中多酚化合物種類最豐富的時期，大豆苷元、香豆雌酚相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

2.4 相關(guān)性分析

分析綠豆多酚抗氧化活性與綠豆芽長、多酚含量及組成的關(guān)系。由表3可知，綠豆芽多酚含量的變化與芽長呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)(P<0.05)，綠豆芽多酚對羥自由基的清除能力與對DPPH的清除能力呈現(xiàn)出極顯著正相關(guān)(P<0.01)。但是通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，綠豆芽多酚的抗氧化能力與多酚含量的關(guān)系并不顯著，分析可能是由于綠豆在芽長4～5 cm時異黃酮類物質(zhì)含量和種類增加，從而使DPPH、羥自由基清除能力及總抗氧化能力增強(qiáng)。這與孫海燕[31]在對干紅葡萄酒多酚組分與抗氧化活性之間相關(guān)性分析結(jié)果一致，認(rèn)為多酚物質(zhì)的抗氧化能力與組分的變化也有顯著關(guān)系。

表3 芽長與綠豆多酚含量及抗氧化活性的關(guān)系

3 結(jié)論

本實驗以綠豆為原料，通過測定多酚含量、組成及抗氧化能力來考察綠豆在發(fā)芽過程中多酚化合物的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠豆在發(fā)芽過程中多酚含量、組成及抗氧化活性均有顯著的變化。在芽長4～5 cm時，綠豆芽多酚含量達(dá)到最高并且表現(xiàn)出最佳的抗氧化活性，多酚含量較未發(fā)芽前提高了38%，綠豆芽多酚對DPPH、羥自由基的清除能力及總抗氧化能力分別達(dá)到93.82%、93.90%、8.32 U/mg，相比于發(fā)芽前提高了8.8%、34%、17.4%，該時期綠豆芽多酚化合物種類最為豐富，大豆苷元、香豆雌酚相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。因此綠豆芽長在4～5 cm時，可以最大程度提高綠豆芽多酚含量及抗氧化活性，并豐富綠豆芽多酚組成，該結(jié)果可以為以后綠豆芽多酚活性物質(zhì)的研究提供參考。