小米多酚的分離純化及其組分分析

朱俊玲 梁 凱 閆巧珍 陳振家 荊 旭 伊 莉 王曉聞 柳青山

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；山西功能食品研究院1，太谷 030801) (山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所2 ，晉中 030600)

谷子(Setariaitalica)又名粟、粱，一年生本草，性喜高溫，耐旱穩(wěn)產(chǎn)，屬禾本科植物。多酚類物質(zhì)具有多種生理功能，對人體健康起著積極的作用[1]。谷物是多酚類物質(zhì)的豐富來源之一，沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素、香豆酸、香草酸、山奈酸、鞣花酸、原花青素、氯化錦葵色素、蘆丁、矢車菊素半乳糖苷等均在谷物中發(fā)現(xiàn)。小米中含有豐富的多酚類物質(zhì)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)0.3%～3%。

大孔樹脂理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸、堿和各種有機(jī)溶劑，具有使用周期長，可再生使用等優(yōu)點(diǎn)。王若蘭等[2]選擇AB-8大孔樹脂對小米多酚分離純化，并優(yōu)化其工藝條件為：上柱速率2 mL/min，上樣液的pH為4左右，濃度為0.12～0.14 mg/mL，洗脫液為70%的乙醇溶液，洗脫速率為1 mL/min。馮進(jìn)等[3]使用HPD400樹脂對藍(lán)莓葉多酚進(jìn)行了分離純化，其純度由38.75%提高到了69.38%。

多酚類物質(zhì)的鑒定方法有化學(xué)鑒定法、紅外光譜法、紫外-可見光譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和核磁共振法等。申芮萌[4]將藍(lán)莓花色苷分離到的組分進(jìn)行紫外掃描，確定了4種花色苷物質(zhì)，3種非花色苷物質(zhì)。李薇茹[5]將研究提取的芹菜多酚在4 500～500 cm-1內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果顯示該物質(zhì)的紅外光譜圖具有酚羥基和苯環(huán)的特征吸收峰，故初步得出該物質(zhì)含有多酚類化合物。萬政敏[6]基于高效液相色譜法在核桃仁中檢測到17種酚酸類物質(zhì)，8種黃酮類物質(zhì)，其中沒食子酸和蘆丁含量是最高的。Ravisankar 等[7]運(yùn)用超高效液相串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法研究了在埃塞俄比亞和美國種植的白色和棕色teff(俗稱苔麩，一種糧食作物)中游離酚和結(jié)合酚的結(jié)構(gòu)，并鑒定出了34種多酚物質(zhì)，主要為黃酮和酚酸物質(zhì)。Kang[8]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法在負(fù)離子模式下在高粱中鑒定出了許多黃酮類物質(zhì)，進(jìn)一步說明高粱是植物多酚類化合物的豐富來源。

本研究使用AB-8大孔樹脂對提取的小米多酚進(jìn)行了分離純化，并對純化后的小米多酚進(jìn)行初步分析鑒定，旨在為小米多酚的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米(東方亮1號(hào))；AB-8大孔樹脂、福林酚、無水甲醇、無水碳酸鈉、氫氧化鈉，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì)，SCIENTZ-18N型真空冷凍干燥機(jī)，BT-100B型數(shù)顯恒流泵，DBS-100型電腦全自動(dòng)部分收集器，IRPRESTIGE-21型傅里葉紅外光譜儀，Waters ACQUITY SQD2型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，玻璃層析柱 (Φ2.6 cm×30 cm)。

1.3 方法

1.3.1 小米多酚的提取

小米多酚的提取參照閆巧珍等[9]復(fù)合酶法提取小米多酚的方法。

1.3.2 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)研究

1.3.2.1 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

精確稱量5 g AB-8大孔樹脂，并加入50 mL小米多酚粗提物溶液(質(zhì)量濃度3.02 mg/mL)，振蕩，條件為25 ℃，180 r/min。此后每1 h取1 mL上清液，做適當(dāng)稀釋后測定其多酚濃度。根據(jù)公式計(jì)算出靜態(tài)吸附量、吸附率并繪制靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線[10]。

式中：C0為實(shí)驗(yàn)前加入小米多酚粗提液的質(zhì)量濃度/mg/mL；C1為吸附平衡后溶液中多酚的質(zhì)量濃度/mg/mL；V1為實(shí)驗(yàn)前加入小米多酚粗提液的體積/mL；M為樹脂質(zhì)量/g。

1.3.2.2 AB-8大孔樹脂靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

用濾紙將吸附完全的樹脂吸干置于250 mL錐形瓶中，倒入80 mL 70%的乙醇溶液，振蕩，條件為25 ℃，180 r/min。24 h后，取錐形瓶中的上清液，做適當(dāng)稀釋后測定其多酚濃度。根據(jù)公式計(jì)算出靜態(tài)解析率。

式中：C2為小米多酚質(zhì)量濃度/mg/mL；V2為加入解吸液的體積/mL；M為樹脂質(zhì)量/g；Q為吸附量/mg/g。

1.3.3 AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)研究

將AB-8大孔樹脂正確裝柱(Φ2.6 cm×30 cm)，柱床體積為3/4，將小米多酚凍干粉配制成一定濃度的多酚溶液后上柱分離純化，每5 mL洗脫液為1管。具體方法為：取100 mL小米多酚粗提液通過0.45 μm有機(jī)濾膜，根據(jù)王若蘭等[2]大孔樹脂分離純化小米多酚的方法與條件對小米多酚進(jìn)行分離純化，并繪制乙醇洗脫曲線，計(jì)算洗脫率。

1.3.4 AB-8大孔樹脂分離純化后小米多酚純度計(jì)算

根據(jù)公式計(jì)算純化前后小米多酚純度[11]。

式中：C為多酚溶液濃度/mg/mL；V為多酚溶液體積/mL；M為凍干后多酚粉末質(zhì)量/g。

1.3.5 AB-8大孔樹脂等溫吸附熱力學(xué)研究

準(zhǔn)確稱取5份AB-8大孔樹脂5 g，分別加入濃度為1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL的小米多酚粗提液50 mL，振蕩，設(shè)置條件為溫度25～35 ℃，180 r/min。24 h后測定多酚濃度，以溶液中的多酚濃度作為橫坐標(biāo)，平衡時(shí)的吸附量為縱坐標(biāo)繪制出AB-8大孔樹脂等溫吸附曲線[12]。

Langmuir等溫吸附公式為：

式中：Ce為達(dá)到平衡后溶液中多酚的質(zhì)量濃度/mg/mL；Qe為平衡時(shí)的吸附量，mg/g；Qm為所能達(dá)到的最大吸附量/mg/g；KL為吸附平衡常數(shù)。

1.3.6 小米多酚的組分分析

1.3.6.1 化學(xué)簡單定性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了三氯化鐵實(shí)驗(yàn)、氯化鈉-明膠實(shí)驗(yàn)、中性醋酸鉛實(shí)驗(yàn)、香草醛-濃鹽酸實(shí)驗(yàn)，通過觀察其顏色變化或沉淀生成，初步鑒定是否含有多酚類物質(zhì)。

1.3.6.2 紅外光譜分析實(shí)驗(yàn)

精確稱量1 mg小米多酚凍干物，加入100 mg溴化鉀混勻，烘干至恒重。倒入研缽中于紅外燈下研磨后進(jìn)行壓片處理。選擇波長范圍為4 000～400 cm-1，先對壓片后的純品溴化鉀用傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行背景掃描，然后對處理后的樣品進(jìn)行掃描[13]。

1.3.6.3 紫外-可見光譜分析實(shí)驗(yàn)

稱取適量小米多酚凍干物，配制成濃度為1 mg/mL的多酚甲醇溶液。將多酚溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，甲醇作為空白試劑，進(jìn)行紫外掃描，設(shè)置波長范圍為800～200 nm，得到小米多酚紫外-可見光譜圖。

1.3.6.4 液相色譜-質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)

將稱取0.521 6 g凍干后的小米多酚，用甲醇定容到100 mL，溶液過0.45 μm有機(jī)濾膜，為淡黃色液體。

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1×50 mm) ；流動(dòng)相：A(超純水)，B(色譜級(jí)乙腈)；流速：0.40 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：2 μL；洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源(ESI源)；掃描方式：全離子掃描，正離子掃描范圍m/z為50～1 500，負(fù)離子掃描范圍m/z為50～1 500；霧化氣體為N2，噴霧氣壓為30 psi；N2流速：800 L/Hr；N2溫度：400 ℃；毛細(xì)管電壓：2 500 V。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析與處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Origin9.1繪圖，用SPSS23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan多重比較進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果

由表2可知，AB-8大孔樹脂對小米多酚的吸附率和解吸率相對較高，這可能是因?yàn)樾∶锥喾优cAB-8大孔樹脂都具有弱極性，AB-8大孔樹脂是含有酰基的樹脂，其可以從極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，也可從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)。因此選擇AB-8大孔樹脂分離純化小米多酚。

由圖1可知，吸附時(shí)間14 h時(shí)完全達(dá)到飽和，此時(shí)吸附量為12.70mg/g。在0～5 h內(nèi)吸附速度較快，這是因?yàn)榇罂讟渲诮萃耆螅奖砻娣e增大，大量的吸附位點(diǎn)暴露出來，加入小米多酚后會(huì)與吸附位點(diǎn)迅速結(jié)合[14]。5 h后吸附量基本趨于平緩，樹脂表面暴露出來的吸附點(diǎn)基本趨于飽和，吸附過程進(jìn)行的速率大大減慢，導(dǎo)致吸附量趨于平緩，10 h后基本已經(jīng)達(dá)到飽和。

圖1 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線

2.2 AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附和解吸動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果

由圖2可知，經(jīng)70%乙醇洗脫后洗脫峰相對集中，基本無拖尾現(xiàn)象。多酚物質(zhì)被洗脫完全后所需洗脫液為300 mL，洗脫率達(dá)84.00%。

圖2 乙醇洗脫曲線

2.3 小米多酚純化前后純度的計(jì)算

小米多酚粗提物純度為31.80%，純化后其純度為72.80%，為純化前的2.3倍，說明純化效果較好。

2.4 AB-8大孔樹脂等溫吸附熱力學(xué)研究

2.4.1 AB-8大孔樹脂等溫吸附曲線

由圖3可知，在25～35 ℃內(nèi)，隨著平衡時(shí)上清液濃度的增大，平衡時(shí)的吸附量也隨之增大，表現(xiàn)出良好的吸附能力，其吸附規(guī)律符合Langmuir吸附理論。同時(shí)，初始濃度相同的情況下，隨著溫度的逐漸升高，平衡時(shí)的吸附量依次降低，說明該樹脂的吸附是放熱過程，在適宜的溫度下吸附量盡可能地增大。

圖3 AB-8大孔樹脂的等溫吸附曲線

表2 AB-8大孔樹脂對小米多酚的靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 Langmui吸附等溫線

由圖4和表3中的R2可知，吸附實(shí)驗(yàn)符合Langmuir吸附理論。隨著溫度的逐漸升高相關(guān)參數(shù)Qm、KL逐漸降低，這可能是因?yàn)闇囟认鄬^高多酚分子運(yùn)動(dòng)迅速，動(dòng)能增大，導(dǎo)致吸附量降低[15]。同時(shí)，Langmuir吸附理論說明AB-8大孔樹脂對小米多酚的吸附是屬于單分子層吸附，故本吸附實(shí)驗(yàn)適用于較低濃度的小米多酚進(jìn)行上樣，若濃度過高則會(huì)導(dǎo)致不必要的浪費(fèi)。

圖4 25～35 ℃下的Langmui吸附等溫曲線

表3 Langmuir等溫吸附方程及相關(guān)參數(shù)

2.5 小米多酚的組分分析

2.5.1 化學(xué)簡單定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，各種實(shí)驗(yàn)反應(yīng)現(xiàn)象均可證明小米提取液中含有多酚類物質(zhì)，且與推測結(jié)果相一致，有利于小米多酚組分的進(jìn)一步分析。

表4 化學(xué)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 紅外光譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 小米多酚紅外吸收光譜圖

表5 小米多酚振動(dòng)峰波數(shù)及其振動(dòng)類型

2.5.3 紫外-可見光譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖6可知，小米多酚在272、330 nm處有2個(gè)吸收峰，通過對比蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的紫外-可見吸收光譜圖可知，兩者的紫外吸收峰稍微有移位，但基本符合黃酮類物質(zhì)的特征。譜帶Ⅰ(300～400 nm)和譜帶Ⅱ(220～280 nm)屬于黃酮類化合物的紫外吸收帶，因此，可推斷出小米多酚中含有黃酮類化合物。

圖6 小米多酚和蘆丁對照品紫外-可見吸收光譜圖

2.5.4 液相色譜-質(zhì)譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合圖7離子流色譜圖，由圖8可知在0.35 min左右處化合物1的負(fù)離子峰[M-H]-質(zhì)荷比為195，所以推測該化合物的分子質(zhì)量為196。通過查閱歐洲Phenol-Explorer多酚數(shù)據(jù)庫與已有研究，可推測出化合物1為羥基咖啡酸。

圖7 小米多酚的離子流色譜圖

圖8 化合物1質(zhì)譜圖(ES-)

結(jié)合離子流色譜圖，由圖9可知在3.47 min左右處化合物2的負(fù)離子峰[M-H]-質(zhì)荷比為483，所以推測該化合物的分子質(zhì)量為484。通過查閱歐洲Phenol-Explorer多酚數(shù)據(jù)庫與已有研究，可推測出化合物2為氯化矢車菊素-3-O-半乳糖苷。

圖9 化合物2質(zhì)譜圖(ES-)

結(jié)合離子流色譜圖，由圖10可知在5.80 min左右處，化合物3的負(fù)離子峰[M-H]-質(zhì)荷比為279，所以推測其分子質(zhì)量為280。通過查閱歐洲Phenol-Explorer多酚數(shù)據(jù)庫與已有研究，可推測出化合物3為對香豆酰蘋果酸[16]，該物質(zhì)為香豆酸衍生物。

咖啡酸在抗油脂氧化方面要強(qiáng)于阿魏酸等其他羥基肉桂酸類化合物[17]。矢車菊素-3-O-半乳糖苷屬于黃酮類物質(zhì)，其可以提高細(xì)胞活力，提高氧化酶活性，抑制自由基氧化[18]。

圖10 化合物3質(zhì)譜圖(ES-)

表6 小米多酚液相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)果

3 討論

采用化學(xué)定性實(shí)驗(yàn)、紅外吸收光譜法、紫外-可見吸收光譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法相結(jié)合對小米多酚組分進(jìn)行分析。由紫外-可見吸收光譜圖可推斷出小米多酚中含有黃酮類化合物，本實(shí)驗(yàn)提取得到的小米多酚為淡黃色粉末，經(jīng)分離純化后顏色進(jìn)一步加深，而黃酮類化合物是一類以2-苯基色原酮作為母核的黃色色素，母核上常含有羥基、甲氧基等助色基團(tuán)，所以黃酮類化合物大多都顯黃色，由此更可證明小米多酚中含有黃酮類物質(zhì)。由得到的高效液相色譜圖可知小米多酚色譜峰較少，故小米多酚所含組分比較單一。此外，由于多酚類化合物分子量范圍很大，當(dāng)分子質(zhì)量大于1 200 U時(shí)，僅僅依靠HPLC-MS無法得到準(zhǔn)確的分子質(zhì)量，同時(shí)對于多酚類物質(zhì)的空間構(gòu)象和基團(tuán)之間的連接方式也不能給出準(zhǔn)確信息，為了進(jìn)一步鑒定小米多酚的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)需采用其他更為先進(jìn)的分析鑒定技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)僅對小米多酚僅做了一級(jí)質(zhì)譜的測定，沒有進(jìn)一步做二級(jí)質(zhì)譜，對小米多酚組分僅做了初步推斷，并沒有對二級(jí)質(zhì)譜中的碎片信息以及裂解規(guī)律進(jìn)行分析，所以需進(jìn)一步進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜的測定，以確定小米多酚中化合物的種類。

4 結(jié)論

使用AB-8大孔樹脂對小米多酚粗提物進(jìn)行分離純化，對其靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附與解吸動(dòng)力學(xué)進(jìn)行探究。純化后小米多酚純度達(dá)72.80%。對小米多酚組分進(jìn)行分析，初步推斷出小米多酚中含有黃酮類化合物。采用HPLC-MS對各組分質(zhì)荷比和分子質(zhì)量測定，初步推斷出小米多酚中含有的主要化合物可能為：羥基咖啡酸、氯化矢車菊素-3-O-半乳糖苷和對香豆酰蘋果酸，而且這3種化合物均為谷物中最為常見的多酚化合物。