花生殼乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌抗菌作用及機理

曹 瑤 戚馨月 汪海峰 周建新

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心；江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023)

花生是世界上重要的油料作物[1]，全球每年花生果產量超過4 200萬t，殼產量約1 800萬t[2]。花生殼是花生產業的一種豐富而廉價的副產品，除少量被制成飼料，大多數被用作取暖和烹飪的燃料或者被當作廢物丟棄，導致資源損失和環境污染[3]。研究表明，花生殼中富含黃酮類化合物，如木犀草素、圣草酚，5,7-二羥色原酮等[4]，作為植物的次生代謝產物，在預防和管理現代疾病如艾滋病[5]、癌癥[6]、炎癥[7]和肥胖[8]發揮重要作用。QIU等[9]采用HPLC-DAD-TOF/MS法對花生殼中的成分進行鑒別，在花生殼的甲醇提取物中發現了3種化合物，分別為5,7-二羥基色原酮、圣草酚和木犀草素，含量分別為0.59、0.92、2.36 mg/g。左愛學等[10]從花生殼乙醇提取物中分離出12種化合物，分別鑒定為木犀草素、香葉木素、圣草酚、5,7-二羥基色原酮、大風子素、5,7,3’,4’-tetrahydroxy-8-prenylflavone、5,7,3’-trihydroxy-4’-methoxy-8prenylflavone、racemoflavone、5-羥基-色原酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、谷甾醇、胡蘿卜苷。YU等[11]和CAMARGO等[12]發現花生殼提取物能夠抑制細菌的生長。戚馨月等[13]采用不同極性的有機溶劑分級提取，發現花生殼分級提取物對不同供試菌均有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強。QIAN等[14]發現木犀草素可以破壞金黃色葡萄球菌細胞膜的完整性，對細菌生物膜的形成具有較強的抑制作用。HE等[15]研究中發現圣草酚對編碼金黃色葡萄球菌外分泌蛋白Hla的基因hla表達和轉錄有明顯的抑制作用。然而，花生殼提取物的抗菌機理鮮見報道。食源性疾病仍然是世界范圍內一個主要的公共衛生問題，其主要原因是食用了細菌、病毒和寄生蟲等病原微生物污染的食品[16]。金黃色葡萄球菌，一種常見的食源性致病菌，進入人體可引起許多急慢性感染[17]。本研究以金黃色葡萄球菌ATCC 6538為指示菌，分析花生殼提取物對其抗菌作用和機理，為開發食品天然防腐劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 指示菌及預處理

金黃色葡萄球菌ATCC 6538購于江蘇省疾病預防控制中心。將ATCC 6538接種于新鮮的胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)中，培養至對數期后按2%轉接至新鮮TSB中，于(36±1) ℃，120 r/min 恒溫搖床振蕩培養18 h至生長對數后期，菌液經12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，使用無菌1×磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌菌體沉淀，重復洗滌兩次后，使用一定量1×PBS重懸，調整菌液濃度為109CFU·mL-1，備用。

1.2 培養基與試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA)、TSB；氯化鈉、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜(DMSO)，以上均為分析純；1×PBS、碘化丙啶(PI)、5(6)-羧基二乙酸熒光素(5(6)-cFDA)。

1.3 花生殼提取物的制備

花生殼洗凈后55 ℃烘干，用高速粉碎機磨碎成粉，過50目篩。準確稱取5 kg花生殼粉用50 L 90%乙醇提取3次，每次3 h，合并提取液。減壓濃縮至無乙醇味，濃縮液加水稀釋至含生藥量0.25 g/mL，共20 L。依次用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次，合并相同溶劑萃取液，減壓濃縮，得到石油醚萃取部位浸膏51.56 g，乙酸乙酯萃取部位浸膏144.63 g，正丁醇萃取部位浸膏22.69 g，均置于-20 ℃冰箱備用。

1.4 儀器與設備

FW100型高速粉碎機，RE-2000型旋轉蒸發儀，LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器，酶標儀，轉盤式激光共聚焦顯微鏡，掃描電子顯微鏡等。

1.5 方法

1.5.1 花生殼各萃取部位對ATCC 6538抗菌活性的測定

參照鄭東超等[18]方法，用DMSO復溶石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取部位浸膏，配制成51.2 mg/mL的母液，各取1 mL將滅菌后直徑為6 mm的濾紙片浸泡于其中4 h，取出瀝干，以DMSO為對照。取1.1節中菌懸液均勻涂布于TSA平板上，將上述濾紙片平鋪于培養皿中。置于(36±1) ℃條件下培養24 h，按十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.5.2 乙酸乙酯萃取物對ATCC 6538抗菌作用的測定

1.5.2.1 MIC和MBC的測定

參照YE等[19]方法，取200 μL無菌TSB加入96孔細胞培養板中，再加入200 μL乙酸乙酯萃取物母液倍比稀釋，使其濃度分別為25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/mL，取1.1中菌懸液4 μL接種至96孔板中，以相同體積無菌水為空白對照，(36±1) ℃條件下培養24 h，測定OD600 nm。以OD600 nm無變化的最低濃度為MIC。將OD600 nm無變化的菌懸液在TSA平板上涂布，菌落數少于5個的最低濃度為MBC。

1.5.2.2 生長曲線及生長動力模型的建立

參照SILVA-ANGULO等[20]方法，取1.1節中菌懸液以2%轉接至新鮮的TSB中培養至穩定期，用無菌TSB調整菌液為104CFU·mL-1，再按1%分別轉接于新鮮的TSB中，向其中加入乙酸乙酯萃取物使其終濃度為1/4 MIC、1/2 MIC、MIC，以添加相同體積的TSB作為空白對照。置于(36±1) ℃培養，每隔2 h取樣在TSA平板上涂布，(36±1) ℃培養24 h后進行菌落計數。

選擇Baranyi模型來擬合其生長狀況，并表征菌株的生長參數。見式(1)：

(1)

式中：y(t)為t時刻菌濃度的對數；y0為初始菌濃度(t=0)的對數；ymax為最大菌濃度的對數；μmax為最大比生長速率；A(t)為調整方程，見式(2)、式(3)。

(2)

y0=μmax×λ

(3)

式中：t為培養時間；v為菌體在生長過程中的增長速率；λ為遲滯時間。

1.5.2.3 致死曲線的建立

參照王虹懿等[21]方法，取1.1節中菌懸液調整至107CFU·mL-1，加入乙酸乙酯萃取物溶液使其最終濃度為MIC、2 MIC及4 MIC，以相同體積1×PBS作為空白對照，置于(36±1) ℃靜置培養，每隔2 h取樣，在TSA平板上涂布，(36±1) ℃培養24 h后進行菌落計數。

1.5.3 乙酸乙酯萃取物對ATCC 6538抗菌機理的研究

1.5.3.1 細胞形態的觀察

參照趙梓雯[22]方法，取1.1中菌懸液調整至107CFU·mL-1，加入乙酸乙酯萃取物溶液使其最終濃度為MIC、2 MIC、4MIC、6 MIC和MBC，以相同體積1×PBS作為空白對照，置于(36±1) ℃培養4 h。10 000 r/min離心10 min，1×PBS洗滌2次，除凈上清液，在室溫下用2.5%的戊二醛固定3 h。10 000 r/min離心5 min，1×PBS洗滌2次，除凈上清液，將樣品依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液對樣品進行洗脫，每次10 min。洗脫結束將樣品固定在鏡片上，置于鍍金儀中真空噴金90 s，拍照。掃描電鏡使用的電壓為10 kV，放大倍數為20 000倍。

1.5.3.2 細胞膜通透性的觀察

參照周祺等[23]和劉國榮等[24]方法，按照上述1.5.3.1中方法制備樣品后，10 000 r/min離心10 min，用1×PBS重懸，向每個樣品中加入5(6)-cFDA至終濃度達到2.5 μmol/L，避光反應10 min；然后加入PI使其終濃度為0.5 μmol/L，避光反應10 min。取5 μL菌液轉接到載玻片上，加上蓋玻片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。激光共聚焦顯微鏡放大倍數為40倍空氣鏡，標尺為110 μm。

1.6 數據處理與分析

每個實驗重復3 次。實驗結果使用Origin8.5 軟件制圖，SPSS 22進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 花生殼各萃取物部位對ATCC 6538的抑菌圈直徑

乙酸乙酯萃取部位有明顯的抑菌圈，直徑為(9.54±0.78) mm，石油醚萃取部位、正丁醇萃取部位及DMSO對照組均無抑菌圈。證明花生殼中抗菌活性物質存在于乙酸乙酯萃取部位及該試劑可作為配制母液的溶劑。

2.2 乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌ATCC 6538的抗菌作用

2.2.1 MIC和MBC

當乙酸乙酯萃取物樣品濃度大于或等于0.80 mg/mL時，樣品菌懸液OD600 nm無變化，由此確定MIC為0.80 mg/mL；當濃度大于或等于6.40 mg/mL時，在TSA平板上菌落數均小于5，因此確定MBC為6.40 mg/mL。

2.2.2 生長曲線及生長動力模型

Baranyi模型特別適用于有延滯、對數、穩定三個階段的生長曲線，其既表達了微生物生長量與時間的關系，也較為準確地評估微生物的遲滯時間(λ)、最大比生長速率(μmax)及最大生長量(ymax)等生長參數[25]。ATCC 6538經不同濃度乙酸乙酯萃取物作用下在TSB中生長的Baranyi模型曲線如圖1所示。

注：—表示ATCC 6538在TSB中的Baranyi模型生長曲線。圖1 ATCC 6538在含有不同濃度乙酸乙酯萃取物的TSB中的生長曲線

由圖1可知，除濃度為MIC外，ATCC 6538在其他幾種濃度的乙酸乙酯萃取物中的生長量實測值皆比較均勻地分布于生長曲線的兩側。各擬合方程R2均大于0.97，說明利用Baranyi模型能很好地擬合指示菌的生長狀況并表征其生長參數，ATCC 6538的生長參數統計如表1所示。

細菌的生長繁殖一般分為4個時期：延滯期、對數期、穩定期和衰亡期[26]。由表1可知，在空白對照組和實驗組中，指示菌菌體初始濃度y0在2.317 0 ～2.755 0 lg CFU·mL-1之間，彼此相差小于1 lg CFU·mL-1。當菌體生長達到穩定期后，空白組與實驗組之間的最大生長量ymax差異顯著(P<0.05)，對照組ymax為9.037 5 lg CFU·mL-1，濃度為1/2 MIC的ymax為6.474 3 lg CFU·mL-1，彼此相差接近3 lg CFU·mL-1，表明乙酸乙酯萃取物能夠抑制ATCC 6538生長，濃度越大抑制越明顯。添加乙酸乙酯萃取物的TSB中ATCC 6538的遲滯時間顯著(P<0.05)大于其在不含有萃取物的TSB中的數值，且呈現濃度依賴性。在乙酸乙酯萃取物作用后，ATCC 6538的最大比生長速率顯著減小(P<0.05)。

表1 ATCC 6538在含不同濃度乙酸乙酯萃取物的TSB中的生長動力學參數

2.2.3 致死曲線

ATCC6538經不同濃度乙酸乙酯萃取物作用下在1×PBS中的致死曲線如圖2所示。

圖2 ATCC 6538在不同濃度乙酸乙酯萃取物中的致死曲線

由圖2可知，不同濃度乙酸乙酯萃取物對其均有殺菌作用，添加乙酸乙酯萃取物的1×PBS中ATCC 6538的活菌數變化顯著(P<0.05)大于其在不含有萃取物的1×PBS中的數值。當添加乙酸乙酯萃取物濃度為1/2 MIC時，作用14 h后活菌數下降至0；當添加乙酸乙酯萃取物濃度為MIC時，作用8 h后活菌數下降至0；當添加乙酸乙酯萃取物濃度為4 MIC時，作用2 h后活菌數下降至0，與空白對照組相比顯著縮短(P<0.05)。

2.3 乙酸乙酯萃取物對ATCC 6538的抗菌機理

2.3.1 細胞形態的觀察

ATCC6538經過乙酸乙酯萃取物作用培養至穩定期在掃描電子顯微鏡下的菌體形態如圖3所示。

圖3 經不同濃度乙酸乙酯萃取物處理的ATCC 6538掃描電子顯微鏡照片

由圖3可知，空白對照組(圖3a)指示菌細胞圓潤飽滿、外形規則且表面光滑。MIC處理組(圖3b)少量細胞表面出現粗糙，2 MIC處理組(圖3c)細胞表面出現粗糙且少量外形皺縮，4 MIC處理組(圖3d)細胞之間開始出現黏連狀態，6 MIC處理組(圖3e)少量細胞出現干癟，MBC處理組(圖3f)大量細胞出現干癟?？梢钥闯鲆宜嵋阴ポ腿∥锬軌蚴怪甘揪毎L時的形態發生變化，且隨著乙酸乙酯萃取物濃度的增加，細胞發生的變化越明顯。說明乙酸乙酯萃取物能夠導致裂解指示菌細胞壁，使胞內物質流出。

2.3.2 細胞膜通透性的觀察

通過激光共聚焦顯微鏡觀察的經乙酸乙酯萃取物作用的ATCC 6538菌體細胞膜通透性如圖4所示。

注：a CK；b MIC；c 2 MIC；d 4 MIC；e 6 MIC；f MBC，放大倍數為40。圖4 經不同濃度乙酸乙酯萃取物處理的ATCC 6538激光共聚焦照片

經過兩種核酸熒光探針5(6)-cFDA和PI染色后，可區分完整細胞膜和膜受損的菌體細胞。如圖4所示，空白對照組(圖4a)和MIC處理組(圖4b)的大部分菌體呈綠色熒光，2 MIC處理組(圖4c)大部分菌體細胞呈中間態橙黃色熒光，4 MIC處理組(圖4d)、6 MIC處理組(圖4e)和MBC處理組(圖4f)絕大多數細胞呈紅色熒光且紅色熒光。以上表明，在未經過乙酸乙酯萃取物作用和低濃度作用的菌體細胞中大多數細胞的細胞膜完整，細胞主要顯示為綠色熒光；隨著作用濃度的增大，PI逐漸進入細胞與5(6)-cFDA競爭取代結合位點，熒光顏色由綠色轉變為橙黃色或紅色，細胞膜受損程度增加。

3 討論

本研究首先通過濾紙片法研究了花生殼石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物對ATCC 6538的抗菌活性，發現其中主要抗菌成分在乙酸乙酯萃取部位。推測是因為乙酸乙酯萃取物成分主要是黃酮類物質，近年來研究報道表明花生殼提取物具有良好的抗菌活性，其主要活性物質為黃酮類物質[27]。

其次研究了乙酸乙酯萃取物對ATCC 6538的抗菌作用，確定其MIC為0.80 mg/mL，MBC為6.40 mg/mL。根據MIC和MBC濃度從指示菌的生長和致死2個角度探討了不同濃度對指示菌的抗菌作用，發現萃取物使指示菌延滯期變長，最大比生長速率降低且最大菌落數減少。這與已報道的花生肽亞鐵螯合物能夠使金黃色葡萄球菌生長緩慢且衰亡期提前報道相似[28]。

此外，從細胞形態和細胞膜的完整性2個角度分別探討了乙酸乙酯萃取物對ATCC 6538的抗菌機理。通過掃描電鏡檢測指示菌的細胞形態，發現萃取物作用后菌體細胞形態明顯被破壞，隨著濃度增大細胞形態出現皺縮干癟，細胞壁破裂，胞內物質流出。這也與已報道的野艾蒿提取物可破壞金黃色葡萄球菌細胞壁的抑制作用相似[29]。結合共聚焦顯微鏡的觀察結果，發現萃取物作用的菌體細胞紅色熒光強度增大，造成指示菌的細胞膜損傷，使指示菌細胞膜形成孔洞，導致細胞膜通透性增加，有研究表明，木犀草素可以破壞金黃色葡萄球菌細胞膜的完整性[14]。利用花生殼提取物作用于常見的食源性致病菌，高效的控制微生物的生長繁殖。

4 結論

花生殼提取物對金黃色葡萄球菌ATCC 6538具有良好的抑制作用，其中主要抗菌成分在乙酸乙酯萃取部位，能夠導致指示菌延滯期變長，最大比生長速率降低，并且通過破壞指示菌的細胞壁和增加細胞膜的通透性，最終表現出抗菌作用。本研究為開發利用花生殼等其他天然植物提取天然防腐劑提供了參考。