乙型肝炎患者血清絲氨酸蛋白酶抑制因子Kazal1表達與病毒載量的相關性分析

劉宏偉 王玉華

1.河北省滄州市傳染病醫院肝病科 (河北 滄州， 061001) 2.河北省滄州市人民醫院檢驗科

乙型肝炎病毒(HBV)感染屬于全球傳染性疾病，嚴重威脅人類健康[1]。HBV持續感染則會導致肝硬化，此外細胞內HBV復制所造成的病理損傷也是引發肝硬化的重要分子機制，乙型肝炎患者血清中HBV DNA載量能夠反映患者病毒感染程度[2,3]。絲氨酸肽酶抑制因子 Kazal 1 型(SPINK1)屬于炎性蛋白，主要分布于肝臟。Lamontagne等[4]研究發現肝癌患者組織中及乙型肝炎病毒攜帶者血清中SPINK1表達水平明顯升高，推測其可能參與肝癌的發展過程。本研究分析SPINK1水平與乙型肝炎患者HBV DNA載量的關系，為乙型肝炎的發病機制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年4月至2019年4月在河北省滄州市傳染病醫院接受治療的157例乙型肝炎患者資料，其中男99例，女58例；年齡23～69歲，平均(47.36±11.32)歲。另選取近期在該院體檢的126例健康者作為對照組，男82例，女44例；年齡22～68歲，平均(45.51±12.27)歲。兩組受試者性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①所有乙型肝炎患者均符合 《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標準[5]；②對照組人群肝功能正常；③年齡<70歲；④所有受試者知情同意。排除標準：①合并自身免疫疾病者；②酒精等其他因素導致的肝炎患者；③未接受抗病毒相關治療者；④近期服用降酶藥物或免疫抑制劑者；⑤復合病毒感染者。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集 入院時收集所有受試者空腹外周血5 ml，加入抗凝劑后，3 000g離心20 min分離血清，在-80℃中凍存。

1.3.2 主要試劑和儀器 RNA提取試劑盒購于Invitrogen公司，貨號:15596018。RNA逆轉錄試劑盒購于Thermo Fisher Scientific公司，貨號：K1622。qPCR反應試劑盒購于艾美捷科技有限公司，貨號P-1029-100。DNA提取試劑盒購于美國Omega公司，貨號：M6229-01。HBV DNA檢測試劑盒購于ROCHE公司，貨號11585614910。人HBsAg酶聯免疫吸附劑測定(ELISA)試劑盒購于上海恒斐生物科技有限公司，貨號:CSB-E10089h-1。抗HBs ELISA試劑盒購于上海羽朵生物科技有限公司，貨號:YDBA042。 HBeAg ELISA試劑盒購于武漢菲恩生物科技有限公司 ，貨號:EH4105。谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)檢測試劑盒購于上海晶抗生物工程有限公司，貨號分別為3185、2349、108226、14867。7500 PCR儀購于美國ABI公司。酶標儀購于北京安麥格貿易有限公司。

1.3.3 RT-PCR法檢測血清中SPINK1 mRNA表達 采用Trizol試劑提取血清總RNA，根據RNA逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄cDNA，SPINK1 引物序列:上游:5′-TAACAGGCATCTTTCTTCT-3′，下游:5′- AGTATTTCCATCAGTCCC -3′；GADPH引物序列：GAPDH上游引物：5′-CAAGTTCAACGGCAGTCA-3′; 下游引物:5′-CCCCATTTGATGTTAGCGGG-3′。20 μl擴增體系：10 μl SYBR Mastermix ，上下游引物分別0.5 μl、2 μl cDNA，ddH2O 7 μl。反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，40個循環。每個樣本設定3個重復，結束后將GAPDH為內參基因，根據2-ΔΔCq算法定量評估SPINK1相對表達量。

1.3.4 RT-PCR法檢測血清HBV-DNA載量 參考DNA提取試劑盒說明提取血清DNA，配制40 μl擴增體系： 20 μl PCR Mix，2 μl 引物混合物，DNA樣品2 μl(樣品/陰性質控品/陽性質控品)，ddH2O 16 μl。混勻后，程序參數設置為93℃ 2 min，1個循環；93℃ 45 s ，55℃ 1 min，10個循環；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30個循環，于55℃ 45 s時采集熒光。

1.3.5 血清抗原標志物、肝功能檢測 采用ELISA法對所有受試者血清中HBsAg、抗HBs、HBeAg、ALT、AST、TBil、DBil水平，具體參考試劑盒說明書進行操作。

2 結果

2.1 兩組受試者血清SPINK1表達水平 乙型肝炎組患者血清中SPINK1 mRNA水平為1.78±0.26，與對照組(1.05±0.12)比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 乙型肝炎患者血清SPINK1表達與HBV DNA載量的關系 乙型肝炎患者血清HBV DNA載量為(5.34,12.45)log10 copies/ml，中位值為7.81 log10 copies/ml。以HBV DNA病毒載量<7.81 log10 copies/ml為低載量組，以HBV DNA病毒載量>7.81 log10 copies/ml為高載量組。高載量組患者血清中SPINK1 mRNA表達為2.06±0.33，與低載量組(1.57±0.46)比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 血清抗原標志物與HBV DNA載量的關系 與低載量組比較，高載量組患者血清HBsAg、HBeAg水平明顯升高，HBcAb水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同HBV DNA載量組患者HBsAg、HBeAg、HBcAb水平比較

2.4 乙型肝炎患者肝功能指標與HBV DNA載量的關系 與低載量組比較，高載量組患者血清ALT水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組患者AST、TBil、DBil水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同HBV DNA載量組ALT、AST、TBil、DBil水平比較

2.5 影響乙型肝炎患者HBV DNA載量的Logistic回歸分析 以乙型肝炎患者HBV DNA載量作為因變量，HBsAg、HBcAb、HBeAg、ALT、SPINK1作為自變量納入Logistic回歸分析。結果顯示，HBeAg(OR=1.586，95%CI=1.028～2.446)、ALT(OR=1.965，95%CI=1.307～2.954)、SPINK1(OR=1.842，95%CI=1.167～2.908)是乙型肝炎患者HBV DNA載量危險影響因素。見表3。

表3 影響乙型肝炎患者HBV DNA載量的因素

2.6 SPINK1與HBV DNA載量、血清抗原標志物、肝功能相關性分析 Pearson相關性分析顯示，SPINK1與HBV DNA載量、HBeAg、ALT呈正相關，差異均有統計學意義(r=0.426，r=0.408，r=0.395，均P<0.05)。見圖1。

圖1 SPINK1與HBV DNA載量、HbeAg、ALT相關性

3 討論

乙型肝炎的病理機制是HBV進入體內后不斷復制，引起病毒血癥，同時HBV復制可干擾肝細胞內大分子的合成，降低溶酶體膜通透性降低，引發肝臟病變[6]。HBV感染初期患者一般無明顯特征，少部分患者會自發清除病毒，但多數患者HBV感染是持續性的，可進一步發展為慢性乙型肝炎，甚至轉變為肝硬化、肝癌。研究發現，乙型肝炎表面抗原、炎癥因子、白細胞介素等均與HBV感染相關，可能影響肝臟功能，進而影響HBV感染的不同結局，深入探究影響HBV DNA載量的分子機制，對于揭示肝炎、肝癌的發生機制具有重要的意義[7,8]。

SPINK1屬于胰蛋白酶抑制劑，定位在染色體5q32位置，其水平的異常表達與腫瘤的異常發生相關[9]。Faisal等[10]研究發現在前列腺患者組織中SPINK表達顯著升高，進一步分析發現與腫瘤浸潤程度、患者預后無明顯關系。Xu等[11]研究發現SPINK1能夠促進肺腺癌細胞的侵襲、遷移，其機制可能與上調基質金屬酶12表達有關，預后分析發現SPINK1高表達是患者預后不良的獨立因素。Shek等[12]研究發現發現SPINK1在人肝癌中高表達，體外實驗發現spink1通過激活c-raf/mek/erk途徑促進腫瘤細胞的增殖、侵襲。王偉等[13]研究發現肝癌患者血清中SPINK1表達明顯升高，對肝癌具有較高的診斷效能，高水平SPINK1表達者生存期明顯低于低水平表達者。目前HBV對SPINK1的作用研究不多，國內學者研究發現丙型肝炎患者血清中SPINK1表達顯著升高，體外研究發現HCV可上調肝癌細胞中SPINK1表達[14]。本研究發現乙型肝炎患者血清中SPINK1表達明顯升高，進一步分析發現隨著HBV DNA載量的增加，乙型肝炎血清中SPINK1表達進一步升高，Pearson相關性分析發現兩者呈顯著正相關，提示SPINK1可能參與乙肝病毒感染過程，與感染程度有關。Logistic回歸分析發現SPINK1是影響患者HBV DNA載量的危險因素，提示高水平SPINK1可能會增加HBV感染風險。

研究發現HBsAg主要用于HBV感染初期篩查和診斷，可用于病毒治療效果評定[15]。HBeAg陽性可作為HBV復制的標志 ，其水平的升高代表傳染性、致病性較強， 當 HBeAg水平降低，則表明HBV復制減少，病情相對穩定[16]。本研究發現高載量組患者血清HBsAg、HBeAg水平明顯升高，HBcAb水平明顯降低，說明隨著病毒復制增多，血清HBsAg、HBeAg水平升高，HBcAb水平降低，三者與HBV感染程度相關。Logistic分析發現HBeAg是影響患者HBV DNA載量的影響因素，說明HBsAg、HBcAb水平的變化可能不能直接反映HBV DNA載量情況，而病毒處于復制狀態時，HBV DNA載量處于較高水平，提示HBeAg水平可反映患者HBV DNA載量。Logistic回歸分析發現HBeAg是影響患者HBV DNA載量的影響因素，說明高水平的HBeAg會進一步影響患者HBV DNA載量。SPINK1、HBeAg均與患者HBV DNA載量相關，進一步采用Pearson相關性分析兩者間的關系發現兩者呈顯著正相關，說明二者可能存在某種相互作用共同參與患者HBV的復制，具體機制尚不明確。

HBV DNA載量是否與肝臟損傷有關，觀點不一，相關學者研究發現血清HBV DNA定量與肝臟炎癥因子及功能指標無明顯相關性[17]；有學者研究認為 HBV DNA載量升高會進一步加重肝臟炎癥損傷，加重感染程度[18]。本研究發現，隨著HBV DNA載量的升高，肝功能相關指標ALT水平升高，表明隨著病毒載量的升高，肝臟受損程度加重，提示病毒復制可能會影響肝功能。Logistic回歸分析發現ALT是影響患者HBV DNA載量的影響因素，說明肝功能受損后會進一步影響患者HBV DNA載量。SPINK1、ALT均與患者HBV DNA載量相關，采用Pearson相關性分析SPINK1、ALT間的關系，發現兩者呈顯著正相關，推測SPINK1上調后會加速病毒復制，進一步損傷肝功能，影響ALT水平。