和厚樸酚對大鼠肝纖維化及P38MAPK/Nrf2信號通路的影響*

符 健 高 藝 林 鋒 李海林

1海南省人民醫院感染科 (海南 海口， 570311) 2.海南醫學院基礎醫學與生命科學學院

肝纖維化是由多種致病因子導致肝臟結締組織異常增生的病理性變化[1]。P38MAPK/Nrf2信號通路是介導細胞凋亡及炎癥反應的信號轉導通路，其能夠通過調節體內炎癥因子及氧化應激損傷，進而參與肝纖維化的病理過程[2，3]。和厚樸酚是從傳統中藥材厚樸中提取的化合物，具有抗炎、抗氧化應激損傷及免疫調節等多種藥理作用[4]。然而，和厚樸酚對于肝纖維化大鼠P38MAPK/Nrf2信號通路的調節作用目前尚未見明確報道。筆者首次研究和厚樸酚對肝纖維化大鼠P38MAPK/Nrf2信號通路的影響，探討和厚樸酚抗大鼠肝纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級成年雄性SD大鼠，6～8周齡，體質量(180±20)g，購于海南醫學院實驗動物中心，動物房溫度(22±2)℃，濕度(50±10)%，適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 藥品及試劑 和厚樸酚購自南京道斯夫生物科技有限公司；HA、LN、PCⅢ、CⅣ酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；TNF-α、IL-6及IL-1β ELISA檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、P38MAPK、p-P38MAPK及Nrf2及GAPDH抗體購自碧云天生物科技有限公司。

1.3 主要儀器及設備 ECLIPSETS100-F型倒置顯微鏡購自日本 Nikon 公司；MRZ14M010型高速冷凍離心機購自美國Beckman公司；SpectraMax190型多功能酶標儀購自上海美谷分子儀器有限公司；ChemiDoc XRS型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；BX50/BX-FLA/DP70型光學/熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.4 模型建立及分組 除正常組15只大鼠外，其余60只大鼠參照文獻方法[5]建立四氯化碳(CCl4)誘導的肝纖維化模型，方法為：每只大鼠按照3 ml/kg的劑量首次腹腔注射CCl4，之后按照3 ml/kg腹腔注射體積分數為50%的CCl4-橄欖油溶液(橄欖油∶CCl4=1∶1)，2次/周，連續給藥8周后，隨機抽取3只大鼠，以戊巴比妥溶液麻醉后斷頸處死，迅速分離肝組織，采用蘇木精-伊紅染色，觀察大鼠肝組織病理情況，以評價造模是否成功。正常組大鼠腹腔注射等量橄欖油。將造模完成后的大鼠按照隨機數字表法分為模型組(15只)、HNK低、中、高劑量組(各14只，簡稱低、中、高劑量組)，低、中、高劑量組大鼠按體重20 μg/kg、40 μg/kg、80 μg/kg的劑量腹腔注射HNK；正常組及模型組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，均1次/d，連續給藥28 d，各組大鼠最后一次給藥24 h后，進行后續實驗。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 檢測血清肝功能指標 每組取6只大鼠，通過眼眶后靜脈叢取血至干凈離心管中，于4℃靜置4 h后置于離心機中4℃，3 500 rpm離心10 min，取上清液，用全自動生化分析儀測定大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT水平。

1.5.2 測定血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平 大鼠眼眶后靜脈叢取血至干凈離心管中，采用上述方法處理，按照ELISA 試劑盒說明書檢測大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.5.3 測定血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平 每組取6只大鼠以10%水合氯醛進行麻醉后取仰臥位，腹主動脈取血至干凈離心管中，按上述方法處理，采用ELISA試劑盒說明書分別檢測大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平。

1.5.4 測定肝組織SOD活性及MDA水平 頸椎脫臼處死大鼠后，取大鼠肝組織，用4℃預冷的生理鹽水洗去表面血液后，用濾紙吸干表面水分，按照試劑盒說明書檢測大鼠肝組織SOD活性及MDA水平。

1.5.5 觀察肝組織病理學變化 大鼠處死后取肝組織，在10%甲醛中固定24 h后轉移至75%的酒精中，經脫水、透明處理，石蠟包埋，進行5 μm切片，水浴，撈片，瀝干，放恒溫箱中烘干，置于烘箱中烤2 h，常規蘇木精-伊紅染色(HE染色)，在顯微鏡下觀察肝組織病理學情況。

1.5.6 檢測肝組織P38MAPK、p-P38MAPK及Nrf2蛋白水平 取大鼠肝組織放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，置于4℃離心機以12 000 rpm離心10 min，用移液槍將上清液移至另一干凈離心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混勻后放入100℃水浴5 min，采用BCA法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉膜，將分離的蛋白電轉移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經P38MAPK、p-P38MAPK、Nrf2及GAPDH抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，應用Image J軟件進行免疫印跡灰度值檢測及定量分析。

2 結果

2.1 各組大鼠血清肝功能指標測定結果 見表1。

表1 各組大鼠血清肝功能指標結果比較

2.2 各組大鼠血清肝纖維化指標測定結果 見表2。

表2 各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平比較

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平測定結果 見表3。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較

2.4 各組大鼠肝組織SOD、MDA水平測定結果 見表4。

表4 各組大鼠肝組織SOD活性及MDA水平比較

2.5 各組大鼠肝組織P38MAPK、p-P38MAPK及Nrf2蛋白水平測定結果 見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織p38MAPK、p-P38MAPK及Nrf2蛋白表達圖與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

2.6 各組大鼠肝組織P38MAPK、p-P38MAPK及Nrf2蛋白電泳情況 見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織蛋白電泳圖

2.7 各組大鼠肝組織病理學檢查結果 見圖3。與對照組相比，模型組大鼠肝組織細胞結構被破壞，細胞變性融合，邊界不清，并可見大量炎性細胞浸潤，肝門靜脈周圍明顯纖維化，可見膽管擴張，肝組織內脂肪空泡形成；與模型組相比，HNK低、中、高劑量組大鼠肝組織病理明顯改善，HNK低劑量組大鼠肝細胞變性及炎性細胞浸潤明顯減輕，肝門靜脈纖維化有所改善，HNK中、高劑量組大鼠肝組織細胞明顯恢復正常，脂肪空泡明顯減少，偶見肝組織細胞炎性浸潤，肝組織纖維化明顯減輕。

A:正常組；B:模型組；C:低劑量組；D:中劑量組；E:高劑量組圖3 各組大鼠肝組織病理圖(HE，×200)

3 討論

肝纖維化是指肝損傷導致的靜止態肝組織星狀細胞激活，釋放大量以平滑肌肌動蛋白和膠原蛋白為主的細胞外基質堆積的病理過程，在一定程度上，肝纖維化是機體進行肝臟損傷自我修復的生理過程，但如果長期不能去除肝損傷的各種誘因，則會發展為不可逆性肝纖維化，進而進展為肝硬化、肝癌等[1]。目前臨床上對肝纖維化的治療主要采用去除炎癥因子及減輕脂質過氧化反應等手段[6]，然而，目前可供臨床選擇的藥物種類有限，其治療有效率也并不理想。

MAPK信號通路是參與細胞凋亡及炎癥因子信號傳遞的重要細胞信號通路，并由一組可被細胞外炎癥因子、激素、細胞毒物質、細胞應激反應等激活的蛋白激酶組成，P38MAPK則是該組蛋白激酶的重要成員之一。研究表明P38MAPK起著調節組織細胞炎癥反應及抗炎癥反應的重要作用，且P38MAPK可隨著肝纖維化的疾病進展而表達增加，同時，P38MAPK的過度激活則又能夠加速肝纖維化的病理進展[7-9]。Nrf2是機體組織細胞抗炎癥反應等生理過程的主要靶點之一，其能夠通過抑制炎癥因子的釋放，緩解氧化應激損傷而發揮作用。在正常組織細胞中，Nrf2與其抑制蛋白Keap1形成復合物而失活；而在氧化應激等刺激下，Nrf2 迅速與Keap1解離后激活，并發生核轉移進入到細胞核，啟動下游相關基因的轉錄，發揮抗氧化作用，促進肝細胞再生，減輕肝臟損傷、抑制肝纖維增生[2，3]。

和厚樸酚是從木蘭科落葉喬木植物厚樸的干皮、根皮及枝皮中提取的單體化合物。現代藥理研究表明，和厚樸酚具有保護神經、抗心肌缺血再灌注損傷及動脈粥樣硬化等多種藥理作用[10]。譚志鑫[11]、劉長海等[12]均報道了和厚樸酚對CCl4誘導的小鼠肝損傷具有一定的防護作用，夏西超等[13]研究表明和厚樸酚能夠提高小鼠肝組織抗氧化能力，減輕小鼠肝損傷。本實驗結果提示和厚樸酚能夠顯著減輕肝纖維化大鼠肝細胞損傷，恢復肝功能、提高肝組織SOD活性，顯著降低肝纖維化大鼠體內炎癥因子水平及氧化應激損傷、促進肝臟損傷因子的去除及肝組織細胞的恢復，使肝組織病理明顯改善。究其機制可能與其抑制P38MAPK的過度表達，并激活調節P38MAPK/Nrf2信號通路有關。