黑苦蕎膠囊對四氧嘧啶糖尿病小鼠的降血糖作用

葛瑞宏，李鵬沖，王 永，王法云，王 慧

（1. 上海交通大學醫學院公共衛生學院，上海市轉化醫學協同創新中心- 食品安全與毒理學評價中心，上海 200025；2. 河南省商業科學研究所有限責任公司，河南鄭州 450002；3. 上海海洋大學食品學院，上海 201306）

糖尿病是由于胰島素分泌不足或機體抵抗胰島素作用而引起的以高血糖為特征的代謝性疾病，是威脅人類健康的慢性疾病之一[1]。隨著經濟的發展和人們生活水平的提高，高糖高脂日常飲食加之各種因素的共同作用使得糖尿病患病人數逐年增加。據2013 年中國慢性疾病監測數據，18 歲及以上人群糖尿病患病率高達10.4%[2]。2014 年世界衛生組織統計，全世界約8.5%的人口患有糖尿病，即有4.22 億糖尿病患者[3]。持續性高血糖可引起血管損害、功能和代謝障礙，產生多種并發癥，防治糖尿病已刻不容緩。

苦蕎（Fagopyrum tataricum（L.） Gaerth.），又稱韃靼苦蕎，是蓼科（Polygobaceae） 蕎麥屬（Fagopyrum） 一年生草本雙子葉植物[4]。近年來，苦蕎由于其獨特的營養價值和突出的醫藥保健功能引起國內外農業、食品營養及醫學界專家學者的廣泛關注和研究興趣[5-8]。苦蕎不僅營養成分豐富，還含有多種生物活性成分[9]。蘆丁及其衍生物具有重要的藥理學活性，是苦蕎降血糖功效成分[10]。苦蕎根據品種的不同分為黑苦蕎和黃苦蕎，黑苦蕎中蘆丁含量是黃苦蕎的3～5 倍[11]。試驗以基于黑苦蕎黃酮的膠囊產品為研究對象，通過其對四氧嘧啶所致高血糖小鼠的降血糖作用，評價其降血糖功能，為黑苦蕎保健食品開發提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試黑苦蕎膠囊樣品由實驗室研制[12]：以黑苦蕎為原料，采用超聲波輔助乙醇回流提取黃酮成分，經真空濃縮、真空干燥得苦蕎黃酮粉，按適當比例添加微晶纖維素、硬脂酸鎂等輔料，再經制粒、過篩和灌裝得黑苦蕎膠囊。相同工藝條件下制備3 批次樣品用于動物試驗，產品批號為20180831，20180903，20180905，置陰涼干燥處保存。

1.2 試驗動物

健康SPF 級昆明小鼠26±2 g 90 只，雄性，試驗動物生產許可證號：SCXK（滬） 2018-0004，合格證號：No.311620400017897；動物維持飼料生產許可證號：蘇飼證（2017） 05005，上海杰思捷實驗動物有限公司提供；屏障動物房試驗條件：溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%。

1.3 儀器與試劑

四氧嘧啶 （C4H2N2O4·H2O），美國 Sigma 公司產品；Freestyle Freedom Lite 血糖儀、血糖試紙（葡萄糖脫氫酶法），雅培貿易（上海） 有限公司產品；UW820S 型電子天平，島津國際貿易（上海） 有限公司產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 體重測定

采用電子天平進行試驗小鼠體重稱量，每次稱量前禁食4 h（不禁水）。

1.4.2 動物分組

購入雄性昆明小鼠90 只，適應1 d 后，禁食4 h（自由飲水）。稱量體重，取尾靜脈血測定其空腹血糖值作為該批次動物基礎血糖值。隨機分為正常組和模型組兩大組。其中，正常組動物30 只，每組15 只，標記為正常空白組和正常高劑量組；模型組動物60 只，造模成功后按血糖水平再隨機分為模型對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，以實際造模成功的動物數量記錄試驗結果，每組動物數量不低于10 只。

1.4.3 劑量選擇與受試物給予方式

根據受試樣品人體推薦攝入量2.7 g / 人/ 日（按60 kg 體重計），設低劑量0.225 g/kg·bw/d，中劑量 0.45 g/kg·bw/d，高劑量 1.35 g/kg·bw/d 3 個劑量組（分別相當于人體推薦攝入量的5 倍，10 倍，30 倍），同時設模型對照組（0 g/kg·bw/d），另設正常動物的受試樣品組（高劑量1.35 g/kg·bw/d） 和空白對照組（0 g/kg·bw/d）。受試樣品（黑苦蕎膠囊內容物） 用蒸餾水配制，低、中、高劑量組配制質量濃度分別為45，90，270 mg/mL，空白對照組 （0 g/kg·bw/d） 及模型對照組（0 g/kg·bw/d） 以蒸餾水代替受試物，經口每日1 次給予小鼠相應質量濃度的受試樣品，小鼠灌胃量為5 mL/kg·bw，連續灌胃30 d，每周稱1 次小鼠體重調整灌胃量。第31 天禁食4 h 后測空腹血糖。

1.4.4 高血糖模型動物造模方法

模型組動物禁食24 h（自由飲水），用低溫下4 ℃無菌生理鹽水配制的13 mg/mL 四氧嘧啶以1 mL/100 g·bw 腹腔注射造模。飼養 5～7 d 后小鼠禁食4 h 進行血糖值的測定，血糖值達10～25 mmol/L即為高血糖模型造模成功的動物[13]。

1.4.5 糖尿病模型動物降血糖試驗

試驗前按照1.4.2 對高血糖模型小鼠進行隨機分組。各劑量組依據小鼠體重及灌胃量要求給予黑苦蕎降血糖膠囊受試物，連續灌胃30 d，每周測1 次體重，根據體重調整灌胃量。模型對照組灌胃相應溶劑。試驗結束，進行空腹血糖值的測定。血糖下降率計算公式如下[13]：

1.4.6 糖尿病模型動物糖耐量試驗

首先，對各劑量組動物進行空腹血糖值的測定，記錄0 h 血糖值；各劑量組灌胃不同濃度的黑苦蕎降血糖膠囊，模型對照組灌胃相同體積的溶劑，20 min后按照2.0 g/kg·bw 灌胃葡萄糖溶液，記錄時間，分別在0.5，2 h 后測定血糖值，計算血糖曲線下面積，計算公式如下[14-15]：

正常組動物糖耐量試驗與1.4.6 相同。

1.5 試驗數據統計

采用Excel 2010 和GraphPad Prism 8.0 軟件進行數據統計分析。所有試驗數據均采用平均值±標準偏差 （SD） 表示。

1.6 結果判定

依據“關于印發抗氧化功能評價方法等9 個保健功能評價方法的通知（國食藥監保化[2012]107 號）”中“輔助降血糖功能評價方法”進行結果判定[13]。

2 結果與分析

2.1 黑苦蕎膠囊對正常小鼠體重的影響

黑苦蕎膠囊對正常小鼠體重的影響見表1。

表1 黑苦蕎膠囊對正常小鼠體重的影響（X±s）

由表1 可知，與灌胃溶劑的空白組相比，正常組小鼠灌胃高劑量黑苦蕎膠囊后其體重在試驗初始（0 d）、中期 （15 d） 和后期 （30 d） 未出現明顯差異 （p＞0.05）。

2.2 黑苦蕎膠囊對正常小鼠空腹血糖的影響

黑苦蕎膠囊對正常小鼠空腹血糖的影響見表2。

表2 黑苦蕎膠囊對正常小鼠空腹血糖的影響（X±s）

由表2 可知，與正常空白組相比，正常組小鼠高劑量灌胃受試物后，試驗初始（0 d）、中期（15 d） 和后期（30 d） 的空腹血糖值未出現明顯差異 （p＞0.05）。

2.3 黑苦蕎膠囊對正常小鼠糖耐量的影響

黑苦蕎膠囊對正常小鼠糖耐量的影響見表3。

表3 黑苦蕎膠囊對正常小鼠糖耐量的影響（X±s）

由表3 可知，正常高劑量組與正常空白組相比，糖耐量無明顯差異（p＞0.05）。

2.4 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠體重的影響

黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠體重的影響見表4。

表4 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠體重的影響（X±s）

由表4 可知，與高血糖模型對照組相比，各劑量組小鼠體重在試驗初始（0 d）、中期（15 d） 和后期 （30 d） 未出現明顯差異 （p＞0. 05）。

2.5 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠空腹血糖的影響

黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠空腹血糖的影響見表5。

表5 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠空腹血糖的影響（X±s）

由表5 可知，經口給予高血糖模型小鼠低、中、高不同劑量的黑苦蕎膠囊，連續30 d 后對各組動物的空腹血糖值進行測定。結果顯示，與未灌胃受試物的模型對照組比較，不同劑量組小鼠空腹血糖值均顯著下降 （p＜0.05）。

2.6 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠糖耐量的影響

黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠糖耐量的影響見表6。

由表6 可知，與模型對照組比較，中劑量小鼠血糖曲線下面積顯著降低（p＜0.05），低劑量小鼠血糖曲線下面積降低極顯著（p＜0.01）。

表6 黑苦蕎膠囊對高血糖模型小鼠糖耐量的影響（X±s）

3 結論

試驗采用CFDA 于2012 年發布的有關保健食品功能評價方法（國食藥監保化[2012]107 號），其對“輔助降血糖功能評價方法”結果判定做出規定，要求2 項檢測指標空腹血糖、糖耐量中至少一項呈現陽性，同時對于血糖正常動物的空腹血糖值沒有任何不良影響，才可判定該受試物具有輔助降血糖功能。試驗數據結果顯示，血糖正常組動物灌胃黑苦蕎膠囊后體重、空腹血糖未出現任何異常現象，與糖尿病模型對照組比較，灌胃不同劑量黑苦蕎膠囊小鼠的血糖下降率明顯增加（p＜0.05）。糖耐量試驗中，低劑量組和中劑量組小鼠血糖曲線下面積顯著降低（p＜0.01，p＜0.05）。由此可以判定，黑苦蕎膠囊輔助降血糖功能動物試驗結果為陽性。

4 討論

現有研究結果表明，苦蕎降血糖作用主要是通過抑制ɑ - 葡萄糖苷酶、改善胰島素抵抗、調節磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt） 信號通路等實現的[16]。ɑ - 葡萄糖苷酶抑制劑作用原理為苦蕎活性成分對消化道內的ɑ - 葡萄糖苷酶產生了抑制作用，降低了淀粉的分解速度，使得葡萄糖濃度降低，減緩消化道對其吸收，降低餐后血糖值。目前，因其獨特的優勢已被廣泛應用于臨床糖尿病治療中。Calzada F 等人[17]研究結果表明，蘆丁能夠改善糖尿病患者的胰島素抵抗和糖脂代謝紊亂，促進人體內的胰島素分泌，提高胰島素受體親和力，具有顯著降血糖功能。晚期糖基化終產物（Advanced Glycation Endproducts AGEs） 被認為是由還原糖類與體內其他營養成分的氨基部分發生非酶促反應后形成的物質，含量過高就有可能致病。AGEs 與糖尿病等慢性疾病密切相關，糖尿病患者組織中的AGEs 含量較高[18]。Lee C C 等人[19]研究發現，苦蕎醇提物和蘆丁能夠通過抑制果糖胺和α - 二羰基化合物降低AGEs的產生。同時，還發現苦蕎醇提物、蘆丁和槲皮素能夠通過促進Akt 磷酸化作用并激活PPARγ 改善肝細胞葡萄糖攝取[20]。此外，苦蕎提取物在保護肝細胞蛋白磷酸化有胰島素類似物的作用。蘆丁被發現還能夠通過刺激大鼠胰腺β 細胞中胰島素受體底物- 2 信號通路緩解β 細胞糖毒性。因此，蘆丁在維持Ⅱ型糖尿病人胰島素信號傳導方面具有內在保護作用。

中國是蕎麥主產國，據FAO 統計，2017 年世界蕎麥種植面積394 萬hm2，總產量383 萬t。其中，中國蕎麥種植面積168 萬hm2，總產量145 萬t，占世界蕎麥總種植面積和總產量的42.7%，37.8%，分居第一、第二位，苦蕎資源得天獨厚。同時，中國也是糖尿病患者最多的國家之一，開發苦蕎降血糖保健食品不僅能夠更好地利用我國現有天然降血糖資源，對健康產業發展也具有一定的意義。