番茄木瓜復合益生菌飲料發酵工藝優化及其抗氧化性

王 輝 ，鐘海旦 ，白衛東 ，曾曉房 ，楊婉媛

（1. 仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510550；2. 仲愷農業工程學院現代農業工程創新研究院，廣東廣州 510225；3. 廣東佳寶集團有限公司，廣東潮州 515638）

根據糧農組織（FAO） 和世界衛生組織（WHO）定義，益生菌是“用量足夠時，能給宿主帶來健康益處的活性微生物”[1]。益生菌具有維持人體腸道菌群平衡、增強胃腸的蠕動、提高消化和吸收水平、促進微量元素的吸收、加強抵抗力、延緩衰老及抑制腐敗微生物生長等多種功能[2]。

番茄，即西紅柿，是番茄屬的一種一年生或多年生草本植物。番茄含有人體所需的多種維生素和豐富的功能性活性物質，具有良好的抗衰老、抗氧化、降低膽固醇、抗癌等效果，還可以起到預防乳腺癌等多種疾病的輔助作用[3]。木瓜是一種熱帶水果，在我國華南地區廣泛種植，富含蔗糖、還原糖、多種維生素及多種氨基酸、黃酮類等活性物質，具有增強人體免疫力、抗氧化、美容、止瀉等作用[4]。

有研究指出，果蔬汁可以作為良好的益生菌發酵基[5]，益生菌發酵果蔬汁不僅可以較好地保留果蔬的營養物質，還兼具益生菌的益生保健功能。近年來，國內外許多學者致力于益生菌發酵果蔬汁的研究。如Mousavi Z E，Ankolekar C，Antunes A E C，Pereira A L F 等人[5-8]將益生菌應用于發酵石榴、蘋果、梨；李海萍[9]將乳酸菌接種至蜜柚汁進行發酵；丘裕[10]將植物乳桿菌應用于番茄、胡蘿卜復合蔬菜汁中發酵；徐安書等人[11]以德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌為菌種，對龍眼混合果蔬汁進行發酵。

目前，國內外對單一益生菌發酵單一果蔬汁或復合果蔬汁及復合益生菌發酵單一果蔬汁的研究報道較多，但對復合益生菌發酵復合果蔬汁研究報道較少。因此，以復合益菌為菌種，以口感和營養價值俱佳的番茄和木瓜為原料，研制出一款兼具番茄、木瓜風味和乳酸發酵風味的復合益生菌發酵飲料，以滿足人們日益增長的消費需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番茄、木瓜，均為市售；雙歧桿菌（Bifidobacterium）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳桿菌（Lactobacillus Plantarum），仲愷農業工程學院輕工食品學院微生物室提供；MRS 肉湯、MRS培養基、平板計數瓊脂培養基（PCA），廣東環凱微生物科技有限公司提供；沒食子酸標準品（95.0%）、蘆丁標準品（99.5%），上海瑞永生物科技有限公司提供；鄰苯三酚、碳酸鈉等，均為分析純。

722N 型可見光分光光度計，上海精密科學儀器有限公司產品；PHS-2F 型pH 計，上海雷磁儀器廠產品；LDZX-50KBS 型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠產品；BG-270 型隔水式培養箱，上海博迅實業有限公司產品；SW-CJ-1FD 型潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄與木瓜益生菌飲料工藝流程

①番茄→清洗→熱燙→去皮→切分→榨汁；

②木瓜→清洗→去皮→切分→熱燙→榨汁；

①+②混合果汁加入蔗糖調配→滅菌→冷卻→接種→發酵→冷藏→成品。

1.2.2 操作要點

（1） 熱燙。將番茄和木瓜用90～95 ℃的水熱燙2 min。

（2） 榨汁。木瓜與水按料液比3∶1，番茄與水按料液比1.5∶1.0 分別榨汁，過濾。

1.2.3 飲料的感官評價

由15 人組成感官評價小組，對產品進行感官評價，取其平均值作為感官評價結果。

感官評價見表1。

1.2.4 發酵劑的制備

（1） 菌種活化。將菌種接種至10%脫脂乳粉溶液，于37 ℃下發酵4 h，將在4 h 內凝固的酸奶接種至已滅菌的10%脫脂乳粉溶液，傳代培養3～4 次，4 ℃下保存。

（2） 菌種馴化。以10%脫脂乳粉溶液與果汁按照9∶1 的配比混合后作為培養基，并逐步降低脫脂乳粉溶液比例至純混合果汁，接種菌種，培養至乳酸菌含量為1.0×107CFU/mL[12]。

表1 感官評價

1.2.5 番茄汁、木瓜汁和菌種配比的研究

（1） 番茄汁、木瓜汁配比的研究。將番茄汁與木瓜汁分別按 50 ∶50，45 ∶55，40 ∶60，35 ∶65，30∶ 70，25∶75，20∶80，15∶85 比例混合后進行感官評價。

（2） 果汁和菌種配比的研究。在菌種添加量3%和蔗糖添加量6%條件下，將比例為25∶75，30∶70，35∶65 的番茄、木瓜汁，分別采用雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌37 ℃下發酵6 h 后，4 ℃下冷藏20 h。以感官評價為主要評價指標，總酸為輔助指標確定菌種搭配。

（3） 菌種比例的研究。在番茄汁與木瓜汁比例為35∶65，菌種添加量3%的條件下，分別加入比例為2∶1，1∶1，1∶2 的雙岐桿菌和植物乳桿菌于37 ℃下發酵6 h，4 ℃下冷藏20 h 后進行感官評價和總酸含量測定。

（4） 發酵工藝單因素試驗。番茄汁、木瓜汁混合比例為35∶65，雙岐桿菌與植物乳桿菌為2∶1 的條件下，固定接種量為3%，發酵溫度為37 ℃，發酵時間為6 h，考查不同蔗糖添加量（3%，4%，5%，6%，7%，8%） 對感官評價和總酸濃度的影響；固定接種量為3%，發酵溫度為37 ℃，蔗糖添加量為 6%，考查發酵時間 （4，5，6，7，8，9 h） 對感官評價和總酸濃度的影響；固定發酵溫度為37 ℃，蔗糖添加量為6%，發酵時間為6 h，考查接種量（2%，3%，4%，5%，6%，7%） 對感官評價和總酸濃度的影響；固定接種量為5%，蔗糖添加量為6%，發酵時間為6 h，考查發酵溫度（35，36，37，38，39， 40 ℃） 對感官評價和總酸濃度的影響。

1.2.6 發酵工藝正交試驗優化

以單因素試驗為基礎進行四因素三水平正交試驗。

正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設計

1.2.7 產品品質評價

可溶性固形物含量使用阿貝折光儀直接測定；pH值使用pH 計直接測定；還原糖含量參照GB 5009.7—2016 測定；總酸含量參照GB/T 1245—2008 測定；菌落總數參照GB 4789.2—2010 測定；乳酸菌數參照GB 4789.35—2016 測定。

1.2.8 抗氧化物質及活性的測定

黃酮含量測定，采用亞硝酸鈉- 硝酸鋁分光光度法[13]測定；總酚含量測定，采用福林酚法[14]測定；超氧化物歧化酶（SOD） 活性測定，采用鄰苯三酚法[15]測定；維C 含量測定，采用分光光度法[16]測定；羥基自由基清除率測定，采用鄰菲咯啉[17]法測定；DPPH 自由基清除率測定，根據李學鵬等人[18]的方法測定。

1.3 數據統計與分析

每個測定均重復3 次，結果表示為平均值±標準偏差。應用SPSS 22.0 軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA） 中的One-Way ANOVA 對所有數據進行方差分析，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析，p＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 番茄汁、木瓜汁配比和菌種的研究

2.1.1 番茄汁、木瓜汁配比的研究

番茄汁、木瓜汁配比的影響見圖1。

圖1 番茄汁、木瓜汁配比的影響

由圖1 可知，當番茄汁與木瓜汁配比為35∶65，30∶70，25∶75 時，感官評分較高。番茄汁添加量過多時，上清液析出、口感偏酸；木瓜汁添加量過多時，木瓜味過于厚重，果汁過于濃稠，感官評分均較低。因此，選取35∶65，30∶70，25∶75 這3 個配比進行果汁、菌種搭配試驗。

2.1.2 番茄汁、木瓜汁與菌種配比的研究

番茄汁、木瓜汁與菌種配比的影響見表3。

由表3 可知，混菌發酵的各項指標明顯高于單一菌種（p＜0.05）；混合菌種中，雙歧桿菌與植物乳桿菌混合菌種產品的總酸和感官評分最高（p＜0.05）；番茄汁與木瓜汁配比為35∶65 時，總酸濃度和感官評分都較高。分析原因可能是由于單菌發酵產物較單一，而混合乳酸發酵多為異型乳酸發酵，反應產物較為豐富, 口感風味更佳[19]。因此，選取雙歧桿菌和植物乳桿菌混合菌種作為發酵菌種，番茄汁與木瓜汁配比確定為35∶65。

表3 番茄汁、木瓜汁與菌種配比的影響

2.1.3 復合益生菌菌種配比的影響

菌種配比的影響見圖2。

由圖2 可知，當植物乳桿菌配比增加時，總酸逐漸降低。分析原因可能是雙歧桿菌和植物乳桿菌都是高產酸菌株，但與雙歧桿菌相比，植物乳桿菌產酸能力更強[20-21]。當雙歧桿菌與植物乳桿菌配比為2∶1 時，產品的感官評分與總酸濃度均最高。因此，雙歧桿菌與植物乳桿菌配比為2∶1 是最佳配比。

圖2 菌種配比的影響

2.2 復合益生菌發酵番茄汁、木瓜汁工藝的優化

2.2.1 蔗糖添加量的影響

蔗糖添加量的影響見圖3。

圖3 蔗糖添加量的影響

由圖3 可知，感官評分和總酸濃度均隨蔗糖添加量增加呈現先上升后下降的趨勢。當蔗糖添加量為2%～6%時，感官評分隨蔗糖添加量增加而逐漸上升；當蔗糖添加量為7%時，因為發酵不充分，甜度過高，感官評分降低；蔗糖添加量為6%時，感官評分最高；當蔗糖添加量為4%時，總酸濃度最高。蔗糖添加量大于或小于4%時，總酸濃度偏低。原因是當蔗糖添加量較小時，總酸濃度比較低，碳源不足；蔗糖添加量過大時，微生物受到較高滲透壓的影響，生長代謝受到抑制，均導致發酵不充分。以感官評價為主要評價指標，總酸為輔助指標的評價標準，選擇蔗糖添加量4%，5%，6%進行正交試驗。

2.2.2 發酵時間的影響

發酵時間的影響見圖4。

圖4 發酵時間的影響

由圖4 可知，總酸濃度隨發酵時間延長呈現逐漸上升的趨勢，感官評分隨發酵時間增加呈現先上升后下降的趨勢。發酵時間為6 h 時，感官評分最高，可能是因為發酵時間不足6 h 時，產品發酵不完全，導致香味和滋味不夠濃郁；發酵時間超過6 h時，總酸濃度過高，導致產品酸味明顯增加，感官評分降低。因此，選取發酵時間5，6，7 h 進行正交試驗。

2.2.3 接種量的影響

接種量的影響見圖5。

圖5 接種量的影響

由圖5 可知，隨著接種量的增加，感官評分先增加后減少，總酸濃度先升高后趨于逐漸穩定。接種量小于5%時，接種量越大，益生菌利用發酸底物產酸速度越快，產酸量越大；接種量達5%后，乳酸菌已充分利用發酵底物產酸，增加接種量對產酸影響變小。接種量為5%時，產品感官評分最高，總酸為2.32 mol/L；接種量大于5%時，感官評分顯著降低。因此，選擇接種量3%，4%，5%進行正交試驗。

2.2.4 發酵溫度的影響

發酵溫度的影響見圖6。

圖6 發酵溫度的影響

由圖6 可知，總酸濃度隨發酵溫度升高呈現先升高后穩定的趨勢，感官評分呈現先升高后下降的趨勢。菌種的生長，發酵產酸，風味物質的形成都有不同的最適溫度，過低和過高溫度對菌種發酵產酸和發酵液的風味和口感會產生影響。發酵溫度過低時，菌種的生長和繁殖速度較慢，果汁未充分發酵，產酸和風味物質均不足；發酵溫度過高時，發酵速度高，但產生的風味不佳。當發酵溫度為37 ℃時，發酵產品感官評分和總酸濃度最高。因此，選擇發酵溫度37，38，39 ℃進行正交試驗。

2.2.5 正交試驗結果與分析

發酵工藝正交試驗結果見表4。

由表4 可知，最優發酵工藝組合為A2B3C1D2，即蔗糖添加量6%，菌種接種量5%，發酵溫度37 ℃，發酵時間6 h。經檢測，該工藝條件下發酵的番茄汁、木瓜汁益生菌飲料的pH 值為3.73，總酸濃度為 2.3 mol/L，菌落總數為7.1×103CFU/mL，乳酸菌數為 5.7×108CFU/mL，均符合 T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素規定》[22]，且酸甜適中，組織狀態均勻，具有果蔬特有風味。

2.3 發酵前后果汁抗氧化物質及活性的變化

表4 發酵工藝正交試驗結果

果汁抗氧化質物及活性的變化見表5。

表5 果汁抗氧化質物及活性的變化

由表5 可知，發酵后，番茄、木瓜益生菌飲料中的SOD 酶活性、總酚含量、黃酮含量均顯著提高（p＜0.05），分別比發酵前增加了28.28%，21.50%，33.01%。但維C 含量由發酵前的43.77 μg/mL 降至發酵后的30.79 μg/mL。可能是因為維C 不穩定，在發酵過程中極易被氧化和維C 在發酵過程中被乳酸菌作為碳源所利用[23]。同時，發酵后對羥基自由基和DPPH 自由基的清除率均顯著提高（p＜0.05），DPPH自由基清除率達到了93.49%。可能是乳酸菌發酵后產生一些糖苷酶去除基化酚類化合物，使抗氧化性增強[24-26]；還可能產品本身含有的多酚、維C、SOD等起到一定的協同作用，從而使產品在發酵后抗氧化性顯著增強。

3 結論

（1） 以番茄和木瓜為原料，確定了復配果汁接種復合益生菌菌種的最佳發酵工藝為番茄汁、木瓜汁混合配比35∶65，雙歧桿菌和植物乳桿菌混合配比2∶1，接種量5%，蔗糖添加量6%，發酵溫度37 ℃。按照該工藝所制得的番茄、木瓜益生菌飲料為橙色，色澤明亮、酸甜適中，具有果蔬特有風味。其可溶性固形物、還原糖含量、pH 值、總酸、菌落總數、乳酸菌數均符合T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素規定》。

（2） 與發酵前相比，發酵后番茄、木瓜益生菌飲料中的SOD 酶活性、總酚和黃酮的含量分別提高28.28%，21.50%和33.01%，維C 含量降低29.70%；同時，抗氧化能力較大程度提高，羥基自由基清除率提高41.50%，DPPH 自由基清除率提高11.35%。