常規抗結核化療對肺結核患者痰液菌群的影響

董文雅 魏文靜 譚衛國 張晨晨 徐華麗 余美玲江振友 周琳， 陳亮

1暨南大學基礎醫學院（廣州510632）；2廣東省結核病控制中心（廣州510630）；3深圳市慢性病防治中心（廣東深圳518020）

結核病是由結核分枝桿菌（Mtb）引起的一種慢性傳染病，已成為威脅人類健康的全球公共衛生問題。自2007年以來結核病一直位居單一傳染性疾病死因之首，其中2019年我國結核病死亡數約為3.1 萬，死亡率為2.2/10 萬［1］。近年來，有研究表明結核病可能主要是由于復雜的微生物群落相互作用導致的，而不僅僅是由Mtb 引起的［2］。呼吸道菌群與人體呼吸道局部的黏膜免疫系統相互作用，保持了呼吸系統的免疫穩定與平衡，在多種呼吸道疾病的發生和發展中起重要作用［3］。相對于肺部組織和支氣管肺泡灌洗液，痰液無侵入性損傷且易獲取，常作為研究肺部微生態的指標之一。然而很少有研究探討痰液菌群與結核病之間的關系，尤其是抗結核化療對結核患者痰液菌群產生的影響。目前，只有兩項研究比較了結核病患者和健康人的痰液菌群［4-5］。此外，CHEUNG 等［6］比較了結核患者和具有類似結核病咳嗽癥狀但Mtb 培養陰性的對照人群痰液菌群之間的差異。

WHO 推廣使用的針對藥物敏感型結核病的標準短程化療方案為連續服用利福平（RIF，R）、異煙肼（INH，H）、乙胺丁醇（EMB，E）和吡嗪酰胺（PZA，Z）2 個月，然后持續服用RIF 和INH 至少4個月。在這些藥物中，INH、PZA 和EMB 是針對分枝桿菌的特異性藥物，而RIF 則是通過抑制RNA聚合酶來對抗多種細菌的廣譜抗生素。多種抗生素長期聯合治療，可能會改變結核患者微生態的多樣性和結構，進而影響治療結果。這一推測最近分別在小鼠［7］和結核患者［8-10］腸道菌群中得到驗證，研究者發現常規抗結核化療可以導致腸道菌群高度失調。至今僅有一項對結核患者痰液菌群的研究涉及抗結核治療，該研究比較了新發、治愈、復發和治療失敗病例以及健康人群的痰液菌群之間的差異，結果顯示與健康對照組相比，新發、復發和治療失敗病例痰菌中普雷沃菌屬減少，鏈球菌屬、Gramulicatella和假單胞菌屬增多，而且在治療失敗和復發病例中，假單胞菌屬明顯高于其他患者［11］。本研究利用16S rRNA 高通量測序，比較抗結核化療期間不同時間點，HRZE 四聯抗生素治療引起結核患者痰液微生物群的變化以及常規抗結核治療對結核患者痰液菌群的影響，為抗結核藥物的合理使用及療效評價提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料該研究為病例對照研究，研究人群為依據肺結核診斷標準（WS288-2008），經過臨床、實驗室及影像學檢查確診為肺結核的患者。選取2017年6-12月［8］深圳市慢性病防治中心初診為結核病且未進行治療的患者為T0 組（54 例），僅經過一線藥物聯合治療2 個月的初診結核患者為T2 組（32 例），經過一線藥物聯合治療6 個月治愈的初診結核患者為T6組（17例）。三組人群在年齡、性別比例上差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。所有受試者均符合以下納入標準：（1）深圳本地人口，作息、飲食規律，不酗酒嗜煙；（2）無合并其他如心、肝、肺、腎功能不全等重大疾病；（3）無糖尿病、惡性腫瘤、HIV 等疾病；（4）入組前2 個月未使用抗生素、微生態制劑。本研究已通過深圳市慢性病防治中心醫學倫理專家委員會認可，所有受試者均已簽署知情同意書。

表1 不同組別受試者的基本情況Tab.1 Characteristics of the participants in different groups±s

表1 不同組別受試者的基本情況Tab.1 Characteristics of the participants in different groups±s

） 女性［例（%）］ 治療時間（月）Reads 數OTUs 數量組別T0 T2 T6例數54 32 17年齡（歲33.9±11.4 35.8±10.8 36.6±13.0 18（33.3）9（28.1）4（23.5）0 2 6 121 706.7±14 849.0 117 280.9±19 550.7 84 916.1±18 002.4 149.2±45.3 112.2±31.1 84.9±26.3

1.2 療效判定標準（1）影像學評價指標見2005年中華醫學會編著的《臨床診療指南：結核病分冊》；（2）細菌學檢測結果評價參見《耐藥結核病化學治療指南》制定的標準。其中治愈指涂陽培陽肺結核患者完成規定的療程，連續3 次涂片結果陰性，并且至少一次痰培養陰轉，在治療末痰涂片陰性。

1.3 痰液采集、保存及微生物DNA提取收取晨痰后，挑取有效痰組織冷藏于-80 ℃冰箱。使用糞便DNA 微型試劑盒（MP Biomedicals）提取來自痰液樣品的DNA。

1.4 16S rRNA 深度測序用正向引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和反向引物907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）對V4-V5 可變區進行PCR 擴增，將樣品特異性的7-bp barcodes納入引物中進行多重測序。擴增程序為：98 ℃預變性2 min，25 個循環（98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸5 min。使用Agencourt AMPure Beads 試劑盒（Beckman Coulter，Indianapolis，IN）對PCR 擴增子進行純化后，用PicoGreen dsDNA 檢測試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）對其進行定量分析。取等量純化后產物送派森諾測序公司進行Illlumina MiSeq 平臺高通量測序。

1.5 DNA 測序和數據處理使用微生物生態學軟件（QIIME2 V.2019.10）對細菌16S rRNA 擴增子數據進行生物信息學分析。使用FastQC v.0.11.2和Trimmomatic v.0.32 對序列進行質量控制和過濾，然后使用QIIME2 內帶的DADA2 軟件對序列reads 進行過濾，構建特征表。采用q2-feature-classifier（QIIME2 V.2019.10）對每個16S rRNA 基因序列進行分類。

1.6 生物信息學分析和統計學方法本文主要使用QIIME2、Python（v3.7）和R 包（v3.6.3）進行序列數據分析。采用q2-diversity（QIIME2 V.2019.10）進行Alpha 和Beta 多樣性分析。Alpha 多樣性反映的是單個樣品物種豐度及物種多樣性，本文采取多種衡量指標：Chao1、Shannon、Simpson、Pielou_e 指數和Observed OTUs。Beta 多樣性比較不同樣品在物種多樣性方面的相似程度，反映腸道菌群的整體差異程度，使用Bray-Curtis 距離指標進行Beta 多樣性分析，并通過主成分分析（PCoA）可視化來研究樣本間微生物群落的結構變化。組間兩兩比較的Bray-Curtis 距離差異采用非參數置換多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）。本研究先用Kruskal-WallisH檢驗比較各分類水平各物種的相對豐度以描述菌群組成結構的差異，進一步通過線性判別分析效應量（LEfSe）找出三組在各分類水平有顯著性差異的菌，用線性判別分析（LDA）評估各組間各分類水平差異菌的效應大小。本研究設定顯著差異的LDA值為2，以尋找兩組間具有顯著性差異的物種，最終取相對豐度＞1%的菌種用柱形圖和熱圖進行可視化展示。本文采用GraphPad Prism7 軟件進行制圖，采用SPSS 23.0 進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 測序數據本研究對收集痰液樣本的16S rRNA V4-V5 可變區進行深度測序以評估HRZE 四聯抗結核治療對肺部微生態的影響。通過對103個樣品測序，共獲得11 768 724 對序列，經雙端序列拼接、過濾后共產生9 803 728條優化序列，每個樣品至少產生58 874條優化序列，平均產生95 181條優化序列，見表1。所有樣品文庫的覆蓋率達99%以上，說明每個樣品的測序量均已達到飽和。

2.2 α多樣性分析本研究利用α多樣性分析法對不同組別間的菌群豐富度和均衡度進行分析，基于OUT種類和豐度計算Shannon、Chao1、Simpson、Pielou_e 和Observed_OTUs 指數。與T0 組結核患者相比，經過常規抗結核化療的患者（T2和T6組），其Shannon、Chao1 和Observed_OTUs指數均顯著下降（均P＜0.05），表明結核患者經化療后體內微生物的豐富度明顯降低。而且隨著治療時間的延長，物種豐富度降低也越明顯，本文的分析結果顯示，與T2組相比，T6組的Shannon、Chao1和Observed_OTUs指數均顯著下降（圖1）。而Pielou_e 指數顯示各組間的菌群均勻度差異無統計學意義，這說明常規抗結核化療可以影響痰液菌群的豐富度，但是對菌群均勻度影響不大。

圖1 組間痰液菌群α多樣性分析Fig.1 α-diversity analysis of sputum flora performed in T0，T2 and T6 groups

2.3 菌群結構分析基于Bray-Curtis 距離指標，本研究使用主成分分析法（PCoA）進一步分析抗結核化療對各組痰液菌群結構多樣性的影響。如圖2所示，PCoA分析發現T0組與T2組、T6組相比較，存在明顯的菌群結構差異（P=0.012）。

圖2 組間痰液菌群PCoA 分析Fig.2 PCoA analysis of sputum flora among groups

隨后本研究比較了各組從門到屬水平上菌群的構成差異（圖3）。在門水平上，T0、T2 和T6 組中占主導地位的菌群主要包括變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）；其中T2 組厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度高于T0 組，放線菌門（Actinobacteria）較T0和T6 組也相對增多。在綱水平上占主導地位的菌群包括擬桿菌綱（Bacteroidia）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、梭菌綱（Clostridia）、芽孢桿菌綱（Bacilli）和γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）。其中T0 組γ-變性菌綱的相對豐度高于T2 和T6 組，而梭菌綱則顯著減少（P＜0.05）。在目、科、屬水平上T0 組的優勢物種與T2 組、T6 組均有不同。

2.4 差異菌群分析為進一步確定哪些菌群受抗結核化療顯著影響，本研究對樣本中平均相對豐度大于1%的物種進行Kruskal-WallisH檢驗分析，在各水平上尋找變化差異較大的菌種。如圖4所示，T2 和T6 組中的產黑色素普雷沃菌（prevotella melaninogenica）、梭菌目（Clostridiales，屬于梭菌綱）、韋榮氏球菌科（Veillonellaceae，屬于梭菌目）、韋榮氏球菌屬（Veillonella，屬于韋榮氏球菌科）及其亞種殊異韋榮菌（veillonella dispar）較T0 組均顯著增加，而伯克氏菌目（Burkholderiales）、紫單胞菌科（Porphyromonadaceae）、黃桿菌目（Flavobacteriales）的相對豐度連續下降。毛螺菌科（Lachnospiraceae）在T6 組較T0、T2 組顯著減少。

圖3 組間不同分類學水平的菌群構成Fig.3 The composition of different taxonomic levels of sputum microbiota among groups

2.5 PICRUSt 功能預測分析PICRUSt 分析結果顯示相較于初診未治患者T0 組，抗結核治療后的患者痰液微生物群中某些功能途徑發生變化，其中最顯著的變化是結核患者菌群中雙組份信號轉導系統、脂肪酸代謝、丁酸代謝、丙酮酸代謝、細菌遷移和趨藥性顯著降低（圖5，均P＜0.05）。這些結果進一步證實，抗結核治療廣泛擾亂了痰液菌群的分類和功能結構，可能導致代謝紊亂。

3 討論

本文通過16S rRNA 高通量測序研究了常規HRZE 抗結核化療對結核患者痰液微生物群的影響?？股刂委熆捎绊懛尾亢湍c道菌群的類型和多樣性，導致菌群紊亂，并常常伴有副作用［12-13］。雖然大多數抗結核藥物（HZE）屬于窄譜，但了解它們對微生物群的影響也有重要意義。本研究結果顯示，HRZE 抗結核化療可影響結核患者痰液菌群整體的多樣性和菌群結構。

最值得關注的是T6 組中韋榮氏球菌屬及其亞種殊異韋榮菌相對豐度經抗結核治療后明顯增加。另外，產黑色素普雷沃菌在治療后也顯著增加。HRZE 引起的痰液菌群紊亂的后果目前還不清楚，但其中一些顯著變化的菌種與結核病的免疫有關。韋榮氏球菌屬是存在于口腔、上呼吸道、小腸和陰道的正常厭氧菌群的一部分，通常被認為是低毒力的［14］。一項對老年肺炎患者上呼吸道菌群的研究表明較高豐度的產黑色素普雷沃菌、韋榮氏球菌屬和纖毛菌屬與健康呈正相關（P＜0.05）［15］。NOJOOMI 等［16］指出韋榮氏球菌屬可以消化乳酸產生丙酸、產生NO、具有抗炎作用，而且它還能產生生物素、鈷胺、葉酸、泛酸、吡哆醇和核黃素，屬于益生菌。產黑色素普雷沃菌能夠減少樹突狀細胞（DC）中由流感嗜血桿菌誘導產生的IL-12p70，而對IL-23 和IL-10 的產生沒有影響，這表明產黑色素普雷沃菌能夠調節對特定病原細菌的免疫反應［17］。另有一項研究發現腸道菌群中富含毛螺菌科和梭菌科的恒河猴更易感染結核菌［18］。本研究結果顯示經過6個月抗結核治療毛螺菌科的相對豐度顯著減少。NAMASIVAYAM 等［7］發現感染結核菌的小鼠在HRZE 抗結核治療過程中，其腸道菌群中梭菌目的相對豐度下降，而紫單胞菌科的相對豐度在治療后顯著上升，而在結核患者痰液菌群中得到相反的結果。綜上所述，可以推測HRZE 引起的肺部菌群紊亂可能會顯著影響宿主的免疫反應，從而影響抗結核化療的療效。

圖4 組間各分類學水平上的差異菌群Fig.4 The different microbiota at each taxonomic level from T0，T2 and T6 subjects

圖5 PICRUSt 功能預測分析Fig.5 Function prediction analysis by PICRUSt

宿主與其菌群之間的交流，部分是通過代謝產物的分泌進行的［19］，代謝產物對宿主的生理功能有著重要的影響。免疫系統可以通過不斷的掃描肺部微環境，獲得有關菌群代謝狀態和定植狀態的信息［20］。最近的研究發現，微生物的代謝物在調節免疫系統中起著重要的作用。腸道菌群可通過改變丁酸和丙酸的產生，導致結核病患者免疫功能受損［9，21］。NEGATU 等［22］發現腸道微生物的代謝物吲哚丙酸可作用于色氨酸，從而干擾Mtb的生物合成。本研究通過PICRUSt 分析，發現HRZE 抗結核化療后的結核患者痰液微生物群丁酸代謝和丙酮酸代謝顯著降低。

綜上所述，HRZE 抗結核化療可引起結核病患者的痰液微生物群紊亂。某些菌種經治療后被消耗或富集，功能分析表明功能通路的組成也發生了變化，為評估抗結核治療效果提供了潛在的生物標志物。這些發現在某種程度上，提供了直接證據驗證抗結核化療引起結核患者肺部菌群失調的假說，并且有利于了解結核病和肺部菌群之間的關系。然而，這一初步的臨床研究結果存在一定的局限性，由于本研究納入的研究對象具有相似的背景和特點，且每一組的研究對象數量較少，因此本研究還需要進一步完善并擴大樣本量，以更大規模的結核患者隊列研究進行驗證。