血液分離大腸埃希菌喹諾酮類抗菌藥物的耐藥機制研究

時培勤，余琪琪，李 鍇△

1.上海交通大學附屬第六人民醫院南院檢驗科，上海 201499；2.上海市奉賢區中心醫院檢驗科，上海 201499

大腸埃希菌是臨床上引起血流感染最常見的病原菌之一，嚴重者可引起菌血癥甚至膿毒血癥。喹諾酮類抗菌藥物是臨床上治療血流感染常用的抗菌藥物之一，隨著耐藥菌株不斷產生，導致該類藥物在血液感染治療中的使用受限[1]。現有的研究主要集中于尿液分離的大腸埃希菌，對血液分離的大腸埃希菌喹諾酮耐藥機制目前未見系統性報道。鑒于臨床血液分離大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物表現出較高水平耐藥，本研究擬對上海交通大學附屬第六人民醫院南院血液分離的50株大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥情況進行分析及其耐藥機制進行初步探究，以期指導臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1菌株來源 試驗材料所涉及的菌株收集于上海交通大學附屬第六人民醫院南院，從2016-2018年老年就診患者(60周歲以上)的血液樣本中分離的大腸埃希菌共50株，其中已排除相同患者相近時間段重復分離的大腸埃希菌，以確保試驗的有效性。

1.2儀器與試劑 ABI Verti型PCR儀由Applied Biosystems公司提供，Syngene·G-BOX-EF2型凝膠成像儀和Nina-drop2000c型DNA定量儀由基因公司提供，Tanon-HE-90C型水平電泳儀由上海天能公司提供，DYY-60型電源由北京六一儀器廠提供，精密分析天平、磁力攪拌器和恒溫搖床(THZ-100型)由上海一恒科學儀器公司提供，Centrifuge 5418R型臺式離心機由Eppendorf公司提供，BACTEC FX全自動血培養系統及需氧微生物培養瓶BD BACTECTM Plus Aerobic/F Culture Vials由BD公司提供，VITEK2全自動細菌藥敏鑒定儀由生物梅里埃公司提供，SC-316型醫用低溫保存箱由賽默飛世爾公司提供；細菌基因組DNA柱式抽提試劑盒、50×TAE緩沖液、DiaSpin柱式DNA膠回收試劑盒、純水(色譜級)、GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain(biotium 10 000×)、寡核苷酸引物(使用前按照說明書要求配成10 μmol/L的溶液)均由上海生物工程股份有限公司提供，LA Taq DNA聚合酶、DNA 標志物(DL2000、1 kb Ladders)、限制性內切酶BamHI、HindIII、T4-DNA連接酶、RNA酶均由Takara公司提供。

1.3方法

1.3.1細菌鑒定和藥敏分析 采集患者適量血液于需氧微生物培養瓶中，上BD BACTEC FX全自動血培養系統進行培養，10～24 h血培養瓶報陽，對陽性血培養瓶進行涂片革蘭染色鏡檢，轉到相應培養基培養，挑取單克隆菌落通過VITEK2全自動細菌鑒定及藥敏分析儀(法國生物梅里埃公司)對菌株進行鑒定和藥敏分析，大腸埃希菌ATCC25922為質控菌株。采用美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)2019 年抗微生物藥物敏感性試驗執行標準(M100)腸桿菌科細菌藥敏試驗最小抑菌濃度(MIC)判讀折點進行判讀，分別進行耐藥性統計。

1.3.2DNA模板的制備 大腸埃希菌接種于血平板，在37 ℃過夜進行增菌，挑取單克隆于5 mL LB液體培養基中(37 ℃ 150 r/min)過夜培養，取1.5 mL菌液離心(10 000 r/min，1 min)棄上清收集菌體，使用細菌基因組DNA提取試劑盒按說明書制備細菌基因組DNA，抽提后-20 ℃保存，作為PCR擴增的模板。

1.3.3檢測由質粒介導的喹諾酮耐藥基因及外排泵基因 對大腸埃希菌質粒介導的喹諾酮類藥物相關耐藥基因[包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac(6′)-Ib-cr]及外排泵基因(包括oqxA、oqxB、qepA)進行檢測，引物序列見表1，引物設計參照文獻[2-3]。腸桿菌基因間重復性一致序列-聚合酶鏈反應(ERIC-PCR)使用引物ERIC2單引物擴增(AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G)，擴增反應試劑使用rTaq Premix PCR。篩查反應體系如下(總體積20.0 μL)：rTaq Premix 10.0 μL，模板1.0 μL，去離子水8.2 μL，上下游引物(10.0 μmol/L)各0.4 μL。擴增所需條件如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃ 5 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠(1% 瓊脂糖)電泳，根據電泳結果分析，將出現陽性條帶的PCR擴增產物送上海生物工程股份有限公司測序分析，并經BLAST比對確認。

表1 PCR擴增引物序列

1.3.4檢測乙酰轉移酶Ib亞型cr變異體編碼基因aac(6′)-Ib-cr 用rTaq Premix PCR反應試劑(大連寶生物)進行擴增，反應體系擴大為50.0 μL，擴增條件同質粒介導喹諾酮耐藥基因檢測，PCR產物送生工生物測序分析，并用軟件Vector NTI advance 11(Invitrogen)分析乙酰轉移酶Ib亞型aac(6′)-Ib突變情況。

1.3.5aac(6′)-Ib基因整合子定位分析 通過重疊PCR的方式，將aac(6′)-Ib基因引物(aacF+aacR)和第1類整合子可變區的引物(intF+3CS)進行交叉擴增，測序分析可變區基因盒排列，進一步驗證整合子的可變區內是否有aac(6′)-Ib基因。

1.3.6菌株同源性分析 使用ERIC-PCR對50株血液分離的大腸埃希菌樣進行同源性分析，引物設計見表1。PCR進行同源性分析的擴增條件為94 ℃ 4 min;94 ℃ 40 s，40 ℃ 1 min，72 ℃ 5 min，40個循環；72 ℃ 10 min。對所得到的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖，80 V，60 min)并分析結果，成像后利用NTSYSpc 2.1e軟件(聚類程序)對PCR產物的電泳模式分析，確定血液分離的大腸埃希菌的系統進化樹。

2 結 果

2.1藥敏結果 在收集的50株血液分離大腸埃希菌中，對環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為82%和78%，同時耐藥的菌株有24株，占比48%，對替加環素、多粘菌素B、哌拉西林/他唑巴坦和氨曲南/阿維巴坦的敏感性為100%，對頭孢菌素類的敏感性分別為頭孢吡肟(54%)、頭孢噻肟(51%)、頭孢他啶(76%)、頭孢唑啉(57%)，對碳青霉烯類抗菌藥物的敏感性分別為亞胺培南(100%)、美羅培南(100%)，對氨基糖苷類抗菌藥物(阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素)的敏感性均為100%。

2.2喹諾酮耐藥基因檢測結果 在24株環丙沙星和左氧氟沙星同時耐藥的大腸埃希菌中，qnrA 基因陽性5株(20.8%，5/24)、qnrC基因陽性2株(8.4%，2/24)、qnrS 基因陽性7株(29.2%，7/24)、藥物外排泵oqxB基因陽性3株(12.5%，3/24)、qnrB 基因陽性1株(4.2%，1/24)、qepA陽性1株(4.2%，1/24)、aac(6′)-Ib-cr陽性12株(50.0%，12/24)，未檢出qnrD、oqxA，其中有兩株分離株上述喹諾酮類耐藥基因均為陰性。

2.3aac(6′)-Ib-cr檢測結果 由于aac(6′)-Ib的突變型aac(6′)-Ib-cr會導致宿主菌對喹諾酮類藥物耐藥，故對12株aac(6′)-Ib陽性的PCR產物進行測序，并通過軟件Vector NTI advance 11(Invitrogen)分析乙酰轉移酶Ib亞型aac(6′)-Ib突變情況，發現有5株大腸埃希菌的aac(6′)-Ib同時發生了Trp60Arg(T180C編碼)和Asp130Tyr(G390T編碼)的突變，其基因型可判定為aac(6′)-Ib-cr。

2.4耐藥基因定位分析結果 在耐藥基因定位分析中，使用重疊PCR方法將aac(6′)-Ib的引物和整合子可變區引物兩對引物交叉擴增，結果發現12株aac(6′)-Ib陽性菌株中有3株aac(6′)-Ib基因位于整合子可變區中，分別為ECO-9：aac(6′)-Ib-cmlA和dfrA1-aac(6′)-Ib-aar3-catB3；ECO-38：aac(6′)-Ib-catB8-aadA1；ECO-4：aac(6′)-Ib-cr-catB3，其中1株ECO-4(aac(6′)-Ib-cr-catB3)為可賦予宿主菌喹諾酮耐藥的突變株。

2.5同源性分析結果 根據NTSYSpc 2.1e軟件(聚類程序)對PCR產物的電泳模式分析確定血液分離的大腸埃希菌的系統進化樹，發現50株血液分離的大腸埃希菌的進化程度不一致，ERIC-PCR電泳圖亦顯示帶型模式多樣，見圖1。

注：A表示1～15號菌株電泳條帶、B表示16～30號菌株電泳條帶、C表示31～45號菌株電泳條帶、D表示46～50號菌株電泳條帶;M表示DNA標志物泳道；1～50為樣本泳道。

3 討 論

研究表明，臨床上大腸埃希菌是引起感染最常見的病原菌之一，喹諾酮類抗菌藥物由于具有血液濃度高、良好的抗菌活性和組織滲透性等優點，常被臨床用于抗感染經驗性治療的首選藥物[4-6]。隨著該類抗菌藥物的廣泛使用，臨床上喹諾酮耐藥菌株不斷產生，血液分離的大腸埃希菌中發現環丙沙星或左氧氟沙星耐藥的情況尤其嚴峻。在臨床分離的菌株中，革蘭陰性菌對喹諾酮類抗菌藥物的靶點主要體現在兩個方面：(1)拓撲異構酶編碼基因parC和parE基因，這兩個基因可以編碼拓撲異構酶Ⅳ；(2)DNA促旋酶A亞基編碼基因gyrA和gyrB基因。研究發現細菌染色體上的這些基因編碼區域是喹諾酮耐藥決定區，該編碼區域發生單個或多個堿基突變是導致細菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥的主要原因[5]。此外，新的耐藥質粒介導的喹諾酮耐藥基因不斷被研究者所發現，較為常見的主要有qnr基因(包括亞型qnrS、qnrD、qnrC、qnrB、qnrA)，氨基糖苷甲基轉移酶aac(6′)-Ib基因的突變型aac(6′)-Ib-cr基因，這些基因表達后所起的作用主要是降低宿主菌對喹諾酮類藥物(環丙沙星、左氧氟沙星)的敏感性，已有研究表明菌株基因組中突變型aac(6′)-Ib-cr基因與第1類整合酶編碼基因的攜帶率呈顯著相關性，且aac(6′)-Ib-cr基因一般位于第1類整合酶可變區中[6-7]。

在本研究中，所收集到的50株非重復分離自就診患者血液標本的大腸埃希菌中就出現了對環丙沙星和左氧氟沙星同時耐藥的24株菌株，并且耐藥率接近了50%，表明在發生血液感染的膿毒癥患者中血液分離大腸埃希菌對環丙沙星耐藥已相當嚴重，這將直接導致臨床診療過程中藥物療效的降低甚至無效，應引起重視。現有研究主要集中于尿液分離的大腸埃希菌，對臨床血液分離的大腸埃希菌喹諾酮耐藥機制目前未見系統性報道。

對于喹諾酮類藥物的耐藥機制，ROBICSEK等[7]報道了質粒介導的喹諾酮類修飾酶基因aac(6′)-Ib-cr，由質粒介導的qnr類耐藥基因一般定位于第1類整合子上，因其編碼可以使Ⅱ型拓撲異構酶和喹諾酮抗性蛋白發生特異性的結合，從而減少宿主菌體內的喹諾酮類的藥物作用的靶點，使細菌產生了耐藥性[8]。目前，國內相關統計數據顯示，喹諾酮類藥物的用藥量僅次于β-內酰胺類，菌株對喹諾酮類抗菌藥物產生的耐藥現象愈加明顯[8]。本研究發現，從血液中分離的大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥機制的主要是質粒介導喹諾酮耐藥基因在臨床菌株中高水平存在，其中qnrA基因陽性5株(20.8%)、qnrB 基因陽性1株(4.2%)、qnrC基因陽性2株(8.4%)、qnrS 基因陽性7株(29.2%)、aac(6′)-Ib-cr基因陽性12株(50.0%)、qepA基因陽性1株(4.2%)、oqxB基因陽性3株(12.5%)。結果顯示，質粒介導喹諾酮耐藥基因中以aac(6′)-Ib-cr為主(50.0%)，為了探究這些菌株是否為相同克隆株，研究者進行了同源性分析，發現這些菌株為非克隆播散，推測耐藥基因可能依靠接合性質粒導致菌株間其發生水平基因轉移現象，具體質粒型別有待后續試驗進一步證實。血液中分離的大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥率低于本研究從尿液樣本中分離的大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥率，但本研究血液中分離的大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥率從2016-2018年呈現逐年升高的趨勢。分析發現，原因在于上海交通大學附屬第六人民醫院南院于2013年升級為三級綜合性醫院，泌尿外科于2015年先后成為區市兩級重點專科，收治重癥患者的能力和人數大幅度提升，并加大了重癥患者血培養送檢率；而且統計發現泌尿外科對喹諾酮類抗菌藥物的使用量亦呈現出逐年增長趨勢，抗菌藥物的選擇壓力也促使這一現象的出現。

本研究中發現1株細菌中aac(6′)-Ib-cr基因定位于第1類整合子可變區中，是aac(6′)-Ib-cr基因依賴整合子在菌株間播散的直接證據。整合子是在細菌基因組中發現的多功能基因獲取系統，可以在細菌之間進行基因的水平轉移，存在于眾多細菌的染色體、質粒或者轉座子上，且具有特定結構的一種遺傳性結構元件，具有基因復雜性，產生表型多樣性和能產生適應性反應的功能基因表達單位[9-10]。近年來的研究發現其在獲得、表達和傳播抗菌藥物抗性基因方面發揮了重要作用[11]。整合子是細菌基因組中常見的外源基因捕獲系統，在宿主細菌捕獲、表達和傳播耐藥基因的過程中發揮著關鍵作用，革蘭陰性菌中其分布尤為廣泛[12-16]。本研究在血液分離的大腸埃希菌中發現aac(6′)-Ib-cr基因以基因盒的形式插入到整合子，依賴于整合子的水平轉移特性進行播散，從而加快了該類耐藥基因的播散，應引起臨床重視。

綜上所述，本研究發現在臨床感染患者血液分離大腸埃希菌中，對大部分抗菌藥物較為敏感，但對環丙沙星和左氧氟沙星耐藥情況比較嚴重。試驗結果顯示其耐藥機制以質粒介導喹諾酮耐藥基因為主，aac基因占主導地位。在上海奉賢區內發現，有3株細菌aac基因定位于第1類整合子可變區，表明存在aac基因依托整合子進行院內播散的風險。其中ECO-4菌株攜帶的aac(6′)-Ib，可以賦予宿主菌喹諾酮抗性表型，進一步證實本院喹諾酮耐藥情況存在進一步加重的潛在可能，需引起臨床及院內感控部門的高度重視。