DCTPP1基因在乳腺癌中的表達及其生物信息學(xué)分析*

賈春麗,路鵬霏,邱 萍,楊 穎,吳 戈,張瑞麗,毛 睿,張 華

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，烏魯木齊 830000)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，全球女性中每年新發(fā)乳腺癌患者約有200萬，乳腺癌的發(fā)病率在逐年增長[1]，嚴重威脅女性健康。而在我國，每年有上萬例女性死于乳腺癌[2]。核苷三磷酸焦磷酸水解酶(NTP-PPase)可以水解核苷三磷酸(d)NTP的磷酸二酯鍵形成核苷單磷酸(d)NMP，釋放焦磷酸。NTP-PPase水解異常核苷酸明顯減少了細胞核苷酸池中的異常核苷酸，避免了DNA合成過程異常核苷酸的摻入，提高了DNA復(fù)制的準確性[3]。DCTPP1基因是NTP-PPase家族中的成員，具有NTP-PPase活性，有研究報道其為抗腫瘤藥物研發(fā)的潛在靶點[4-5]，在DNA復(fù)制過程中發(fā)揮了重要作用[6]。然而，目前對DCTPPl在臨床乳腺癌組織中的表達及功能等相關(guān)研究報道較少。本研究旨在利用腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)庫，明確DCTPPl在乳腺癌中的表達、分布狀態(tài)及與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，探討DCTPP1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的功能，為DCTPP1基因在乳腺癌中的研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

TCGA(The Cancer Genome，Atlas http://cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫包括了腫瘤病例臨床基本信息，如基本資料，治療進程，臨床分期，腫瘤病理及生存狀況，包括mRNA、microRNA、Copy Number、Mutation、Protein、Methylation信息等。利用ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/)對TCGA數(shù)據(jù)庫中包括乳腺癌組織和及正常組織中的多種腫瘤組織及正常組織中DCTPP1基因mRNA的表達水平進行分析。Human Protein Reference Database是一個專門存儲人類蛋白質(zhì)相互作用信息的數(shù)據(jù)庫，在該網(wǎng)站查詢DCTPP1基因在乳腺癌組織及正常組織中蛋白的表達狀況。

1.2 方法

1.2.1生存分析

利用基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)數(shù)據(jù)庫加載了TCGA數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)數(shù)據(jù)，利用其中乳腺癌患者DCTPP1基因mRNA的表達數(shù)據(jù)分析DCTPP1基因表達水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

1.2.2病理亞型及年齡狀況

采用ualcan數(shù)據(jù)庫中存儲的TCGA 數(shù)據(jù)分析DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、病理亞型的表達狀況。

1.2.3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

genemania數(shù)據(jù)庫可提供蛋白-蛋白，蛋白-DNA 和遺傳相互作用、通路、生理生化反應(yīng)等信息，利用該數(shù)據(jù)庫DCTPP1蛋白參與的蛋白-蛋白，遺傳相互作用和通路、蛋白共表達網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4基因功能

WebGestalt是一個基因功能富集分析的在線網(wǎng)站，將與DCTPP1基因相互作用的關(guān)鍵基因利用WebGestalt進行GO分析，了解其參與的細胞組分、生物過程、生物功能。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Kaplan-Meier生存分析計算生存率，采用logrank檢驗估計生存率的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織及正常組織中DCTPP1基因的差異性表達結(jié)果

通過ualcan網(wǎng)站在線分析TCGA乳腺癌患者數(shù)據(jù)庫中乳腺癌基因表達的相關(guān)信息，對比1 097例乳腺癌組織與114例正常乳腺組織中DCTPP1基因mRNA的表達水平發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中的表達水平明顯高于正常乳腺組織(P<0.01)，見圖1。

圖1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌組織及正常乳腺組織DCTPP1基因mRNA的表達水平

2.2 DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、病理亞型的表達水平

基于ualcan數(shù)據(jù)庫進行分析，結(jié)果顯示，TNM臨床分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達水平顯著高于正常乳腺組織(P<0.01)，Ⅲ期乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達水平與Ⅰ期乳腺癌組織中該基因的表達相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Luminal型乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達水平顯著高于正常乳腺組織(P<0.05)，HER-2過表達型、三陰型乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達水平明顯高于正常乳腺組織(P<0.05)，見圖2。各病理亞型乳腺癌組織中DCTPP1基因表達均高于正常乳腺組織(P<0.01),其中Lumnial型乳腺癌該基因的表達明顯高于三陰型乳腺癌(P<0.01)，見圖3。

圖2 正常乳腺組織與不同分期乳腺癌組織中DCTPP1基因mRNA表達水平比較

圖3 正常乳腺組織與不同病理分型乳腺癌組織中DCTPP1基因mRNA表達水平比較

2.3 DCTPP1蛋白乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，乳腺小葉癌組織中和乳腺導(dǎo)管癌組織中DCTPP1基因的表達呈現(xiàn)強陽性。進一步觀察乳腺癌組織中DCTPPl蛋白陽性的細胞分布格局，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的細胞膜、細胞質(zhì)及細胞核均有DCTPPl蛋白的表達，其中細胞質(zhì)淺棕黃色，細胞核及細胞膜呈棕褐色。在正常乳腺組織中，DCTPPl在部分腺體細胞表達，主要位于細胞核與細胞膜，在脂肪組織中不表達，見圖4。

A、B：浸潤性癌；C、D：導(dǎo)管癌；E、F：正常乳腺組織。

2.4 DCTPP1基因表達水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析DCTPP1基因不同表達水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)，分析1 070例乳腺癌患者的總體生存時間，以DCTPP1基因表達的中位數(shù)為標準將患者分為DCTPP1基因高表達組(n=535)與DCTPP1基因低表達組(n=535)，分析結(jié)果表明，相對于低表達的患者，DCTPP1基因高表達降低了乳腺癌患者總體生存時間(HR=1.9,P<0.01)，見圖5。

圖5 基于TCGA數(shù)據(jù)庫中DCTPP1基因不同表達水平乳腺癌患者總體生存率分析

2.5 DCTPP1蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測及功能分析

genemania分析共篩選出20個DCTPP1基因相互作用蛋白質(zhì)：BAP1、CAPZB、CIAPIN1、CTPS1、HERC4、LGI1、LGI2、LGI3、LGI4、MRPL21、NUBP1、PCNA、PDE12、PLK1、POLR3K、RAD23A、TSPEAR、UBQLN1、WDR74、XPNPEP1，相互作用關(guān)系包括物理相互作用、共表達、共享蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、共定位，見圖6。

圖6 DCTPP1基因相互作用蛋白分析

2.6 GO分析

對上述基因參與的生物學(xué)過程、細胞組分、分子功能進行分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要參與了代謝過程、生物調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、細胞通信等過程。DCTPP1基因相關(guān)基因位于多種細胞成分中，包括細胞質(zhì)、細胞核、囊泡、線粒體、被膜等。分子功能包括結(jié)合蛋白質(zhì)、結(jié)合離子、水解酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、結(jié)合核苷酸、結(jié)合核酸等，見圖7。

A：生物學(xué)過程；B：細胞組分；C：分子功能。

3 討 論

世界范圍內(nèi)，美國和北歐是乳腺癌高發(fā)，而亞洲地區(qū)發(fā)病率最低[7]，中國不是乳腺癌的高發(fā)國家，但由于人口基數(shù)龐大，每年女性乳腺癌新發(fā)病例的絕對數(shù)很多，位居世界第2位；每年因乳腺癌死亡的人數(shù)位列中國女性因腫瘤死亡人數(shù)的第6位[8-9]。近年來血管內(nèi)皮生長因子、人表皮生長因子受體、細胞周期檢查點調(diào)節(jié)劑等靶向藥物在乳腺癌中的應(yīng)用逐漸增多，然而這些靶點僅存在于部分乳腺癌患者，因此尋找乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子或靶點，對開發(fā)新的治療乳腺癌的靶向藥物具有重要意義。

人體內(nèi)的正常細胞在不斷進行自我更新，其中極為關(guān)鍵步驟是DNA復(fù)制，而該過程是細胞中是一個非常準確的過程，每代每個基因產(chǎn)生10-7個錯誤[10]，該過程出現(xiàn)差錯會導(dǎo)致基因發(fā)生突變，發(fā)生突變細胞中的一部分細胞就會變成前癌細胞。在人體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的作用下前癌細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞。腫瘤細胞內(nèi)異常核苷酸代謝對于腫瘤微環(huán)境的形成和維持、腫瘤細胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等有著非常重要的作用[11]。

NTP-PPase家族在低等的原核生物和高等真核生物中都存在，該酶水解底物包括核苷三磷酸和異常核苷三磷酸[3]。NTP-PPase若缺失會導(dǎo)致DNA突變的增加，并影響細胞分裂。如大腸桿菌的MutT酶可以選擇性清除核苷酸池中的氧化核苷酸8-oxo-dGTP和2-OH-dATP，這一過程阻止了氧化應(yīng)激導(dǎo)致的異常核苷酸摻入到DNA中造成的DNA損傷。在大腸桿菌中MutT的缺失導(dǎo)致大腸桿菌的AT-CG突變率大大增加[12]。在結(jié)核分枝桿菌中的MazG水解dUTP、2-hydroxy-dATP和8-oxo-dGTP等，該酶缺失可以造成編碼利福平抗性基因的突變明顯增多，從而影響結(jié)核分枝桿菌的正常生長[13]。因此，NTP-PPase在生物過程中不斷分解細胞代謝過程中的異常核苷酸，保證了DNA復(fù)制的準確性及生物體基因組的穩(wěn)定性。而作為被在人類細胞中發(fā)現(xiàn)的具有典型MazG結(jié)構(gòu)域的NTP-PPase，DCTPP1基因是眾多已發(fā)現(xiàn)的NTP-PPase中研究報道較少的活性蛋白分子，對其酶學(xué)特性及功能研究結(jié)果提示該分子可以特異性水解dCTP和結(jié)構(gòu)類似物如5-甲基-dCTP和5-鹵-DCTP[14]。

ZHANG等[4]研究多種腫瘤中DCTPP1基因的表達模式及與對應(yīng)的癌旁組織之間的表達差異，與癌旁組織中的表達進行對比發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中DCTPP1基因顯著高表達，而DCTPP1基因在胃癌及結(jié)直腸癌中的表達并沒有顯著差異，同時在不同組織學(xué)亞型的腫瘤中表達狀況也不同。本研究結(jié)果顯示，DCTPP1基因在乳腺癌組織中的表達明顯高于正常乳腺組織。這與上述腫瘤中DCTPP1基因的表達模式相同。DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、不同分子病理分型(Lumnial型、HER-2陽性過表達型、三陰型)的表達均較正常組織高，且以Lumnial型、三陰型明顯。在Human Protein Reference Database數(shù)據(jù)庫中對乳腺癌組織及正常乳腺組織采用免疫組織化學(xué)法檢測DCTPP1蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，DCTPP1蛋白在乳腺導(dǎo)管癌及小葉癌中的表達均高于正常乳腺組織，SONG等[14]研究了161例乳腺癌組織和132例癌旁組織，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示DCTPP1基因在癌組織中過表達，且在細胞核中的表達濃聚，這與本課題組研究結(jié)果一致，DCTPP1基因與腫瘤密切相關(guān)。

本課題組分析1 070例乳腺癌患者的總體生存時間后發(fā)現(xiàn)高表達DCTPP1基因的乳腺癌患者總體生存時間明顯縮短，MORISAKI等[15]在對胃癌干細胞的蛋白組學(xué)進行比對分析后研究發(fā)現(xiàn)DCTPP1基因的活化轉(zhuǎn)移可能與胃癌干細胞中DNA的復(fù)制相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)DCTPP1基因的高表達與胃癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。LU等[16]在前列腺癌中也有同樣的發(fā)現(xiàn)，提示DCTPP1基因與乳腺癌、前列腺癌、胃癌的不良預(yù)后相關(guān)，提示DCTPP1基因可能是腫瘤患者預(yù)后不良因素。

REQUENA等[17]探究了DCTPP1基因在細胞核苷酸同源性中的作用,研究了這種酶的廣泛表征,發(fā)現(xiàn)該酶在細胞核、細胞質(zhì)和線粒體中普遍存在,在正常細胞代謝過程中,DCTPP1基因可催化dCTP水解成dCMP，從而將dCMP池維持在胸苷酸合成的水平。dCTP/dTTP的適當(dāng)比例對于維持核苷酸庫中生理穩(wěn)態(tài)十分重要。DCTPP1基因在細胞中的活性可能參與核苷酸庫中dCTP濃度的調(diào)節(jié)，影響細胞內(nèi)核苷酸庫中dCTP/dTTP 的比例。現(xiàn)有研究顯示NTP-PPase細胞代謝過程中的消除異常的核苷酸，發(fā)揮著“清理門戶”功能[3]。XIA等[5]隨后在對胃癌中的研究發(fā)現(xiàn)高表達的DCTPP1基因通過對MDRl的去甲基化作用促進了胃癌對化療的耐藥性。通過與DCTPP1基因相關(guān)的蛋白進一步探究DCTPP1基因的功能發(fā)現(xiàn)，此類蛋白廣泛分布于細胞各個結(jié)構(gòu)中，參與細胞的代謝生長過程，蛋白結(jié)合過程。LU等[16]研究發(fā)現(xiàn)過表達DCTPP1基因促進前列腺癌腫瘤細胞的生長。REQUENA等[18]在對人宮頸癌細胞株Hela的研究發(fā)現(xiàn)DCTPP1基因可增加化療藥物的抗腫瘤活性。王佳琦等[19]研究證實雷公藤可以直接與DCTPP1基因相互作用，抑制DCTPP1基因酶的活性從而干預(yù)腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，DCTPP1基因在乳腺癌組織中高表達，且與乳腺癌患者不良預(yù)后相關(guān)，可能參與了乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程，對該基因進一步研究可協(xié)助評估患者預(yù)后并為乳腺癌的治療提供新的干預(yù)靶點。