不同物料堆肥富里酸的結(jié)構(gòu)特征的研究

張 強(qiáng),席北斗,楊津津,李紹康,李 翔*,趙昕宇 (1.蘭州交通大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院,甘肅 蘭州730070；2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100012；3.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院國(guó)家環(huán)境保護(hù)地下水污染模擬與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100012)

堆肥是一種實(shí)現(xiàn)固體廢物資源化和無(wú)害化的有效手段[1].世界上每年都會(huì)產(chǎn)生大量的有機(jī)固體廢物,其產(chǎn)量持續(xù)增加將會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生影響[2-3].堆肥過(guò)程可以產(chǎn)生穩(wěn)定的有機(jī)產(chǎn)品腐殖質(zhì)[4-5],其作為電子穿梭體具有修復(fù)土壤、降解和固定重金屬或有機(jī)雜質(zhì)的功能[6].腐殖質(zhì)可以在生物地球化學(xué)循環(huán)的氧化還原過(guò)程中發(fā)揮重要作用,并在很大程度上影響環(huán)境中有機(jī)和無(wú)機(jī)污染物的氧化還原和降解[7-8].因此,調(diào)節(jié)高活性腐殖質(zhì)成為了提高堆肥質(zhì)量的一種手段.一般情況下,腐殖質(zhì)被認(rèn)為是由胡敏酸、富里酸和胡敏素三種成分組成[9-10].富里酸作為腐殖質(zhì)的重要組分之一[11],具有較強(qiáng)的溶解性,移動(dòng)性和污染物親和力[12];富里酸可以將大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及某些礦物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子,使得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更容易被微生物吸收利用,從而微生物活性增強(qiáng)[13].研究表明,富里酸具有一定的電子轉(zhuǎn)移能力[14-15],這進(jìn)一步說(shuō)明了富里酸的重要性.然而,不同類型物料堆肥過(guò)程中形成的富里酸不盡相同.因此,有必要研究堆肥系統(tǒng)中富里酸的結(jié)構(gòu)和變化.一直以來(lái),人們致力于堆肥過(guò)程中富里酸組分含量變化的研究.但是,對(duì)于富里酸的結(jié)構(gòu)和組成以及形成機(jī)理尚不清楚.

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和三維熒光光譜(EEMs)是表征有機(jī)物相對(duì)簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)高效的方法.但是,由于許多分子信號(hào)的重疊,僅使用紅外或熒光光譜通常無(wú)法為分子水平有機(jī)物的理解提供更多的信息[16].二維相關(guān)光譜(2DCOS)可以通過(guò)沿第二維擴(kuò)展光譜提供有關(guān)分子結(jié)構(gòu)變化的相對(duì)方向和順序來(lái)區(qū)分重疊的峰[17].因此,在有機(jī)物研究中2DCOS 的新興應(yīng)用可以極大地增進(jìn)人們對(duì)有機(jī)分子組成的相互作用和演化機(jī)理的理解.

基于此,本文針對(duì)富含木質(zhì)纖維素類物料和富含木質(zhì)素類物料堆肥過(guò)程中各個(gè)階段形成的富里酸進(jìn)行二維紅外相關(guān)光譜分析,揭示堆肥不同階段富里酸形成過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化.基于三維熒光組分的二維熒光相關(guān)光譜與結(jié)構(gòu)方程模型結(jié)合,揭示了不同物料堆肥過(guò)程中富里酸的結(jié)構(gòu)組成及形成機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 堆肥方法

堆肥試驗(yàn)場(chǎng)地為上海某堆肥廠,該堆肥廠面積為 12.4hm2,試驗(yàn)采集果蔬廢物(FVW),雜草廢物(WW),秸稈廢物(SW)和園林修剪廢物(GW)為堆肥原料.表1 顯示了堆肥物料的初始有機(jī)成分,即半纖維素、纖維素和木質(zhì)素.按有機(jī)成分可將FVW 和WW 劃分為富含木質(zhì)纖維素類物料,將SW 和GW劃分為富含木質(zhì)素類物料.堆體為條垛形式.平均每m3的堆肥物料約為0.75t,每個(gè)堆體高為1.5m、寬為3m,因此一個(gè)堆體堆肥物料約為10.6t.采用1%尿素或木屑調(diào)至其一致的C:N,范圍為25～35:1.新鮮物料含水率較高,將其曬干,使其含水率在50%～60%.在堆肥過(guò)程中定期翻堆、通風(fēng),4 種堆肥到達(dá)高溫期溫度范圍在 58～62℃,后又經(jīng)歷30d 的降溫期.分別在堆肥升溫期(0,2,5d)、高溫期(6,8,10d)和降溫期(15,25,35d)均勻采集堆體上、中、下、左、右5 個(gè)位點(diǎn)的樣品,將樣品均勻混合,以確保其一致性.采集樣品總量為2kg,其中一部分的樣品凍干備用,剩余儲(chǔ)存于零下20℃冰箱.

表1 堆肥物料的初始有機(jī)成分Table 1 The initial organic composition of the compost material

1.2 富里酸的提取與純化

腐殖酸提取方法采用國(guó)際腐殖酸協(xié)會(huì)(IHSS)的堿浸提方法:取3g 堆肥樣品,按照1:10 固液比加入0.1mol/L NaOH 與0.1mol/L Na4P2O7混合液.在25℃條件下180r/min 浸提16h,4℃,10000r/min 離心20min,棄沉淀.上清液過(guò)0.45μm 濾膜,即為腐殖酸提取液.取一定量腐殖酸提取液,用6mol/L HCl 調(diào)至pH 值至1.0,靜置12h 后溶液中出現(xiàn)沉淀物質(zhì),其中沉淀是不易溶于酸性條件的胡敏酸組分,上清液是酸溶性富里酸組分.混合溶液4℃、10000r/min離心10min,使沉淀和溶液分離.獲得的上清液利用XAD-7 交換樹脂進(jìn)行純化,去除其中的親水性雜質(zhì)組分,即獲得純凈的富里酸溶液,一部分凍干后用于紅外光譜測(cè)定.

1.3 富里酸化學(xué)結(jié)構(gòu)特征分析

1.3.1 紅外光譜測(cè)定 將 1mg 凍干的富里酸(Fulvic acid, FA)樣品與300mg 光譜級(jí)干燥的KBr混合,然后將混合物在10000kPa 下加壓2min.使用Nicolet Nexus FTIR 分光光度計(jì),以4000～400cm-1的分辨率測(cè)量FTIR 光譜.

1.3.2 富里酸三維熒光光譜的掃描 掃描光譜之前,將樣品TOC 調(diào)為10mg/L.狹縫寬帶:Ex=5nm;Em=5nm;掃描速度為1200nm/min,PMT電壓為700V,信噪比＞110;響應(yīng)時(shí)間:自動(dòng).樣品熒光光譜掃描參數(shù)如下:發(fā)射光譜:發(fā)射波長(zhǎng)(Em)掃描范圍為280～550nm,對(duì)應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)的掃描范圍為200～450nm.固定波長(zhǎng)差Δλ=Em—Ex=55nm.

1.4 二維相關(guān)光譜

本文中,堆肥樣品分為富含木質(zhì)纖維素和富含木質(zhì)素兩類,FTIR 和EEMs 的2DCOS 兩種類別的FTIR/EEMs 熒光值均獲得.y 的2D 光譜變化可以是外部變量和n 個(gè)等距點(diǎn)處的光譜變量的函數(shù),可以表示為:

動(dòng)態(tài)光譜y(x,C)的清晰定義如下:

通過(guò)離散Hilbert-Noda 變換生成了兩個(gè)圖(同步(Ф)和異步(Ψ)相關(guān)譜):

二維相關(guān)性分析提供了2 個(gè)不同的圖形.同步圖顯示了在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每個(gè)波段變化的相關(guān)性,以及它們之間的相關(guān)性是增加還是減少.異步相關(guān)圖將該信息與發(fā)生的事件順序相關(guān)聯(lián)[18].

1.5 數(shù)據(jù)分析

將兩類物料在3 個(gè)階段(升溫期、高溫期、降溫期)的富里酸樣品轉(zhuǎn)化為三維的數(shù)據(jù)矩陣(21×50×55Em), 在MATLAB2019a(Mathworks, Natick,MA)上的DOMFluor toolbox(www.models. life.ku.dk)使用平行因子對(duì)三維數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行解析.通過(guò)Origin 2018 處理平行因子得到的Fmax 值來(lái)表示樣品中不同組分的相對(duì)含量.然后將兩類物料平行因子分析結(jié)果中的EX loading 數(shù)據(jù)通過(guò)2D shige 軟件進(jìn)行二維相關(guān)分析.將3 個(gè)階段的富里酸的紅外原始光譜導(dǎo)入Origin2018 軟件,然后通過(guò)峰值擬合功能自動(dòng)得到紅外官能團(tuán)的相對(duì)含量.最后用SPSS Amos23 構(gòu)建結(jié)構(gòu)方程模型(SEM).在進(jìn)行SEM 分析之前,自回歸相關(guān)結(jié)構(gòu)用于識(shí)別IBM SPSS AMOS 23 數(shù)據(jù)中的潛在自相關(guān).本文在AMOS23 軟件中使用卡方檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)擬合的質(zhì)量,例如,如果P值＞ 0.05,則此模型比較可靠.最后,迭代地刪除所有不重要的缺失路徑,并每次都重新測(cè)試模型的可靠性.此外,本文使用SEM 的標(biāo)準(zhǔn)化總效果來(lái)驗(yàn)證模型中的間接和直接關(guān)系.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同類型物料富里酸熒光組分分析

為研究不同類型物料堆肥過(guò)程中形成的富里酸組成及組分變化,采用平行因子分析法(PARAFAC)對(duì)富里酸的熒光光譜進(jìn)行解析.如圖1所示,富含木質(zhì)纖維類物料堆肥形成的富里酸的組分1(C1),在Ex/Em 波長(zhǎng)為230(330)nm/415nm 時(shí)具有次要和主要熒光峰.該組分為類富里酸類物質(zhì)[19].而富含木質(zhì)素類物料堆肥形成的富里酸的類富里酸組分C1,只在Ex/Em 波長(zhǎng)為330nm/415nm 時(shí)具有一個(gè)主要熒光峰.說(shuō)明木質(zhì)纖維素類物料堆肥形成富里酸的過(guò)程中有助于形成230nm 處的峰,而木質(zhì)素類物料堆肥形成富里酸的過(guò)程中有助于減少230nm 處的峰.較短波長(zhǎng)的成分往往是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的低分子量物質(zhì)[20-21],很容易被微生物降解.不同來(lái)源富里酸組分2(C2)的熒光峰,表現(xiàn)出相同的激發(fā)/發(fā)射(Ex/Em)波長(zhǎng).并且都在Ex/Em 波長(zhǎng)為225(275)nm/350nm 時(shí)具有次要和主要熒光峰.在Ex/Em 波長(zhǎng)225(275)nm/350nm 為類酪氨酸類物質(zhì)[22-23],說(shuō)明兩類物料堆肥都形成了類酪氨酸組分C2,該峰不僅與酪氨酸類物質(zhì)相關(guān),還與可溶性微生物代謝副產(chǎn)物和苯環(huán)類物質(zhì)有關(guān)[24].不同來(lái)源富里酸組分3(C3)的熒光峰,表現(xiàn)出相同的激發(fā)/發(fā)射(Ex/Em)波長(zhǎng).并且都在Ex/Em 波長(zhǎng)為225nm/300nm 時(shí)具有主要熒光峰.根據(jù)已有文獻(xiàn)表明,在Ex/Em 波長(zhǎng)225nm/300nm處為類色氨酸類物質(zhì)[25].即兩類物料堆肥都形成了類色氨酸組分C3,由此可知,在堆肥過(guò)程中微生物以類色氨酸物質(zhì)為碳源.

2.2 不同來(lái)源富里酸不同階段組分及官能團(tuán)變化

紅外光譜用于鑒定富里酸中存在的官能團(tuán).使用特征吸收帶的強(qiáng)度確定富里酸中官能團(tuán)的相對(duì)含量(圖 2a).966cm-1附近出現(xiàn)的峰是芳環(huán)上的δ(CH)的振動(dòng)[26],1650cm-1附近出現(xiàn)的峰是歸因于as(COO)的振動(dòng)[27],2866cm-1附近出現(xiàn)的峰通常表示脂肪族基團(tuán)附近的as(CH3)和(CH2)的振動(dòng)[28-29].在WW 和SW 中,芳環(huán)的含量分別增加了約10%和5%,這說(shuō)明富里酸的芳構(gòu)化可能發(fā)生在中后期;并且WW 堆肥形成的富里酸中芳環(huán)含量較高,說(shuō)明富含纖維素類物料堆肥形成的富里酸結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定.并且在WW 和SW 中,脂肪族的含量分別下降了約10%和6%,這說(shuō)明堆肥形成富里酸的時(shí)候可能以脂肪族為碳源;并且WW 堆肥形成的富里酸中脂肪族含量減少更多,說(shuō)明富含木質(zhì)纖維素類物料堆肥過(guò)程中脂肪族更容易被降解.

圖1 兩類物料堆肥形成富里酸的三維熒光平行因子分析組分圖Fig.1 Three-dimensional fluorescence parallel factor analysis component composition of fulvic acid formed by composting two types of materials

基于熒光光譜-平行因子分析,根據(jù)熒光組分得 分值Fmax 變化,得到不同物料堆肥過(guò)程中形成的富里酸組分的變化(圖2b).根據(jù)EEM-PARAFAC 結(jié)果可知,除SW 外,其它物料在堆肥的升溫期,類色氨酸組分C3 含量最高,隨著堆肥的進(jìn)行該熒光組分所占比例有所降低,而類富里酸物質(zhì)的熒光組分C1 所占比例呈增加趨勢(shì).這是因?yàn)殡S著堆肥進(jìn)行,富里酸中類色氨酸組分C3 隨微生物降解其百分含量逐漸降低,逐漸轉(zhuǎn)化為類富里酸類物質(zhì)[30].類富里酸是結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定的組分,這源于堆肥過(guò)程微生物對(duì)木質(zhì)素與纖維素類物質(zhì)的降解[31].C2 在堆肥過(guò)程無(wú)明顯變化,這代表了酪氨酸與苯醌類物質(zhì)含量的綜合變化.從圖2b 還可以看出,除GW 外,FVW 和WW 堆肥形成的富里酸中組分3 的減少量遠(yuǎn)高于SW.說(shuō)明富含木質(zhì)纖維素類物料堆肥形成的富里酸中的類色氨酸更容易被降解為較穩(wěn)定的類富里酸組分C1,即富含木質(zhì)纖維素類物料堆肥形成的富里酸更穩(wěn)定.與紅外分析得出的結(jié)論一致.

圖2 兩類物料在不同堆肥階段形成的富里酸組分含量占比Fig.2 The percentage of fulvic acid components formed by composting two types of materials

2.3 不同來(lái)源堆肥過(guò)程富里酸的結(jié)構(gòu)演化

如圖3a 所示,在波長(zhǎng)對(duì)220/220、275/275 和330/330 處觀察到3 個(gè)自動(dòng)峰值,并且在波長(zhǎng)對(duì)280～330 / 220 處檢測(cè)到負(fù)交叉峰;圖3b 中檢測(cè)到以275/220和330/275的波長(zhǎng)對(duì)為中心的2個(gè)正交叉峰.此外,在圖中的波長(zhǎng)對(duì)275/240 和330/220 處觀察到2 個(gè)負(fù)交叉峰.根據(jù)Noda 的規(guī)則[32],這些觀察結(jié)果可以解釋為熒光光譜中優(yōu)先熒光強(qiáng)度發(fā)生變化的順序是330nm＞220nm＞275nm 和240nm＞275nm.以上結(jié)果表明,木質(zhì)纖維素類物料堆肥形成的富里酸中各組分變化順序如下:類色氨酸物質(zhì)＞類富里酸物質(zhì)和類酪氨酸物質(zhì)＞類富里酸物質(zhì).

如圖3b 所示,在波長(zhǎng)對(duì)220/220 和330/330 處觀察到2 個(gè)自動(dòng)峰值,并且在波長(zhǎng)280～350/220 處檢測(cè)到負(fù)交叉峰;圖3b 中檢測(cè)到以275/220 和330/275的波長(zhǎng)對(duì)為中心的2 個(gè)正交叉峰.此外,在圖中的波長(zhǎng)對(duì)275/240 和380/220 處觀察到2 個(gè)負(fù)交叉峰.根據(jù)Noda 的規(guī)則[32],這些觀察結(jié)果可以解釋為熒光光譜中優(yōu)先熒光強(qiáng)度發(fā)生變化的順序是 380nm＞220nm＞275nm和330nm＞275nm以及240nm＞275nm.以上結(jié)果表明,木質(zhì)素類物料堆肥形成的富里酸中各組分變化順序如下:類色氨酸物質(zhì)和類酪氨酸物質(zhì)＞類富里酸物質(zhì).通過(guò)對(duì)比,發(fā)現(xiàn)不同物料堆肥形成的FA 中熒光組分變化順序基本相同,說(shuō)明這些大分子物質(zhì)的形成存在一定規(guī)律.

為了得到不同來(lái)源富里酸內(nèi)部結(jié)構(gòu)的詳細(xì)演變,本文通過(guò)紅外光譜和熒光光譜進(jìn)行了二維異質(zhì)光譜分析.如圖4a所示,在波長(zhǎng)對(duì)840/220～360處檢測(cè)到正交叉峰,在異步圖4b 中觀察到波長(zhǎng)對(duì)840/240 和840/285～390 的2 處負(fù)交叉峰.通過(guò)判斷規(guī)則,木質(zhì)纖維素類物料堆肥形成的FA 中組分變化順序是240＞840 和285～390＞840.以上結(jié)果表明,木質(zhì)纖維素類物料堆肥形成的富里酸中各組分變化順序如下,類色氨酸、類酪氨酸、類富里酸＞脂肪族基團(tuán)和芳環(huán).

圖3 富含木質(zhì)纖維素和木質(zhì)素的物料堆肥形成的富里酸的二維熒光光譜Fig.3 Two-dimensional fluorescence spectrum of fulvic acid formed by composting materials rich in lignocellulose and lignin

圖4 富含木質(zhì)纖維素和木質(zhì)素類物料堆肥形成的富里酸的二維紅外-熒光異質(zhì)光譜Fig.4 Two-dimensional infrared-fluorescence heterogeneous spectrum of fulvic acid formed by composting lignocellulose and lignin-like materials

如圖4c 所示,在波長(zhǎng)對(duì)870/265～360、1650/220和3250/220 處檢測(cè)到正交叉峰,在異步圖4b 中觀察到波長(zhǎng)3250/220 處的負(fù)交叉峰以及840/295～380 處的正交叉峰.通過(guò)判斷規(guī)則,木質(zhì)纖維素類物料堆肥形成的FA 中組分變化順序是220＞3250 和840＞295～380.以上結(jié)果表明,木質(zhì)素類物料堆肥形成的富里酸中各組分變化順序如下,類酪氨酸＞羧基和醇基;芳環(huán)和脂族基團(tuán)＞類酪氨酸.

2.4 不同物料堆肥形成的富里酸組分間的關(guān)系

通過(guò)結(jié)構(gòu)方程模型來(lái)檢測(cè)富里酸各成分之間的直接或間接影響(圖5).結(jié)果表明,類富里酸與類色氨酸(λ=-0.840,P＜0.05)(圖5a)的形成顯著相關(guān);類酪氨酸與類色氨酸(λ=0.898,P＜0.05)(圖5b)的形成顯著相關(guān);羧基與類酪氨酸(λ=0.687,P＜0.05)(圖5b)的形成顯著相關(guān).此外可以看出芳環(huán)與類富里酸(λ=0.546,P＜0.05)(圖5a)、羧基(λ=0.715,P＜0.05)(圖5a)及脂肪基團(tuán)(λ=0.546,P＜0.05)(圖5b)的形成顯著相關(guān).

圖5 不同物料堆肥形成的富里酸中不同組分間的關(guān)系Fig.5 Relationship between different components in fulvic acid formed by composting different materials

3 結(jié)語(yǔ)

盡管富含木質(zhì)纖維素類物料和富含木質(zhì)素類物料的熒光組分含量及變化基本相似,但是兩類堆肥物料形成的富里酸結(jié)構(gòu)存在顯著差異,并且特征官能團(tuán)與其熒光組分的形成先后順序不同.在木質(zhì)纖維素類堆肥過(guò)程中,富里酸結(jié)構(gòu)中類酪氨酸和類色氨酸的形成優(yōu)先于芳環(huán);而在木質(zhì)類堆肥過(guò)程中,富里酸中的芳環(huán)的形成優(yōu)先于類酪氨酸和類色氨酸.此外,類富里酸,脂肪族基團(tuán)和羧基是影響富里酸中芳環(huán)形成的關(guān)鍵基團(tuán)與組分.