牛糞發酵沼液DOM 與Fe(III)離子絡合機制研究

劉玉丹,謝 鑫,謝莉鴻,田媛媛,楊 夢,郭旭晶 (成都信息工程大學資源與環境學院,四川 成都 610225)

厭氧發酵主要利用生物質為原料在厭氧環境下產生能源產品沼氣,厭氧發酵過程中會產生大量的沼液.沼液中含有豐富的氮磷鉀和多種植物生長需要的氨基酸、蛋白質、赤霉素等成分[1-2],能夠為農業生產提供了優質肥源,提高土壤肥力[3-4].溶解性有機物(DOM)是厭氧發酵沼液中主要的有機組分.DOM 中包含眾多的可以生物利用的營養元素(C、N、P、S)以及多種活性官能團組分(—CH2、O—H、羧基、酰胺等)[5-6],是一種極其活躍的有機組分.

此外,DOM 中還包含碳水化合物和眾多有機酸,如氨基酸、類腐殖酸、類腐富里酸.這些有機成分能夠被微生物利用,促進微生物的新陳代謝[7-8].而重金屬進入富含DOM 的環境后必然會發生絡合、離子交換、吸附解吸的等物理化學過程.沼液DOM 具有的官能團對重金屬等離子的吸附絡合能力遠遠超過其他礦質膠體.當沼液施用于土壤后,能夠對土壤重金屬的遷移轉化和最終歸宿產生重要影響[9].

鐵元素(Fe)是地球上含量最多的金屬元素,在植物生長過程中起著至關重要的作用,如葉綠素的合成、鐵硫蛋白的重要組成元素、植物呼吸作用等都離不開鐵元素[10].植物中的鐵元素主要來源于土壤,利用根系細胞對鐵元素進行吸收利用,土壤中適量的鐵元素是必須的.但鐵元素一旦過量,就會造成土壤重金屬污染,從而導致植物中的鐵元素過量,影響植物發育.在施加沼液的土壤中,DOM 中的活性基團與Fe 發生吸附、絡合、氧化還原等一系列反應,使Fe 由游離態轉化為與有機物結合的穩定態,促進鐵離子的富集.若對植物實行定點施肥,則在DOM的作用下,在植物周圍Fe 會較施肥前更快的速度向植物附近轉移,有利于植物對鐵元素的吸收[11].此外,DOM 中的有機酸能夠導致碳酸鹽結合態Fe 轉化成離子交換態,而鐵錳氧化態的Fe 在厭氧環境中容易轉化成離子交換態,從而增加了DOM 與Fe 發生絡合作用的可能性[9,12].

目前,在溶解性有機物DOM 與重金屬的研究中,大多數文獻主要報道DOM 對Cu、Cd、Pb、Zn、Cr、Hg 等遷移轉化的影響[9,13-14],對金屬Fe 的研究甚少,尤其是沼液作為有機肥施用于土壤時,其DOM 對土壤中Fe 的遷移轉化、形態分布和植物吸收與利用.因此,研究牛糞發酵沼液DOM 和Fe(III)絡合作用顯得尤為重要.光譜分析技術已經廣泛的用于研究重金屬與DOM 的絡合作用,如紫外、紅外和熒光光譜結合平行因子(PARAFAC)分析及二維相關光譜(2D-COS)分析來解釋重金屬與DOM的絡合異質性及機制[9,13].而多種光譜結合分析手段用于研究DOM 與Fe(III)的絡合作用能夠更好地理解熒光有機物對Fe(III)的絡合異質性和機制及絡合點信息,從機理上揭示沼液DOM 熒光有機物對土壤中Fe(III)的遷移轉化、形態分布和植物吸收與利用的影響.因此,本研究主要采用紅外光譜和熒光光譜技術結合二維相關光譜技術分析對牛糞厭氧發酵液DOM 與Fe(III)絡合機制,揭示沼液施用后DOM 對Fe(III)遷移和轉化的影響,可為沼液施用土壤后對重金屬遷移和轉化過程提供依據.

1 材料與方法

1.1 樣本收集與處理

沼液樣本采集于某大型沼氣工程正常運行時期所產生的沼液.沼氣工程采用養牛場產生的牛糞為發酵原料.發酵溫度為35℃.沼液采用5L 的棕色聚乙烯瓶收集,收集的沼液運回實驗室后立即過0.45μm 的有機濾膜提取DOM 樣本,并置于4℃的冰箱中保存備用.

1.2 熒光猝滅滴定

熒光猝滅滴定前,采用Milli-Q 超純水將DOM溶液濃度調整到6mg/L.沼氣發酵過程中pH值的最適宜范圍在 6.8～7.5,因此本實驗 pH 值調整為7.00±0.02.取一系列20mL 的DOM 樣本置于50mL的離心管中,并實驗設置一組平行實驗.分別添加金屬離子不同體積的Fe(III)溶液于離心管中,添加金屬溶液體積不能超過總體積的5%.最終,金屬離子的濃度在0～150μmol/L.將樣本置于水平振蕩器,在20℃避光條件下水平振蕩反應16h 后立即進行光譜測定.pH 值采用pHS-3 型pH 計測定(杭州奧利龍儀器有限公司,中國).實驗所用的Fe(III)為分析純硝酸鹽.

1.3 光譜測定

同步熒光光譜(SYN)采用日立F-7000 分子熒光光譜儀(Hitachi,Japan)進行測定.激發發射波長差為 60nm, 掃 描 范 圍 250～500nm, 掃 描 速 度240nm/min.Milli-Q 超純水作為空白樣本被扣除.將DOM-Fe(III)絡合物進行冷凍干燥得到粉末進行FTIR 分析.紅外光譜分析采用 Perkin—Elmer Spectrum One 傅里葉紅外轉換光譜儀(Perkin—Elmer,USA)進行分析,測試范圍為3600 到400cm?1.

1.4 絡合模型

絡合模型采用雙對數猝滅模型[15],絡合參數可由下式確定:

式中:F0和F 分別為未添加金屬離子和添加了金屬離子時的熒光強度值;logK 為對數條件穩定常數;n絡合位點數;[Q]為DOM 中金屬的濃度.

1.5 PARAFAC 分析

平行因子分析采用 DOM Fluor toolbox 在Matlab 10.0 進行程序運算,共108 個DOM 金屬絡合物樣本(包含Cd、Pb、Cu、Zn、Cr 等金屬與牛糞發酵沼液DOM絡合樣本)進行PARAFAC分析.模型可以識別處6 個獨立的熒光組分.

1.6 二維相關光譜分析

二維相關光譜是一種結合了實驗設計和數據處理的技術,它強調由外界擾動(如溫度、壓力、濃度等)引起的光譜變化的細微特征,將光譜的吸收峰在二維尺度上展開,提高光譜分辨率,有可能區分在一維光譜上掩蓋的小峰和弱峰,從而提高光譜的解釋能力[16].二維相關光譜包括同步光譜和異步光譜,同步光譜關于主對角線對稱,包含自動峰和交叉峰,而自動峰在主對角線上,交叉峰在主對角線兩側出現.異步光譜關于主對角線反對稱,只包含交叉峰,不存在自動峰.Noda and Ozaki 已經對二維相關光譜分析原理進行了詳細的介紹[17].本文采用不同金屬濃度作為外界擾動下的SYS及FTIR進行二維相關分析.“2D Shige”軟件用于分析和繪制二維相關光譜圖.

2 結果與討論

2.1 DOM-Fe(III)絡合物平行因子分析

圖1 表明,6 個熒光的組分能夠被PARAFAC 模型識別,組分C1(component 1)在Ex/Em 為250nm/405nm 和320nm/405nm 處,主要由類富里酸熒光引起的[7].組分C2(component 2)為類色氨酸熒光峰,在Ex/Em 為235nm/350nm 和280nm/350nm 處,主要由類蛋白物質熒光引起的[9].組分C3(component 3)分別在發射波長為360nm 和420nm 處存在兩組熒光峰.在Ex/Em 為230(275)/360nm 處的熒光峰主要由類色氨酸熒光導致的,而在 Ex/Em 為 230(275)/420nm 處的熒光峰是由類富里酸熒光物質引起的.結果表明,類色氨酸熒光物質能夠與類富里酸熒光組分結合.組分C4和C5(component 4和component 5)分別在發射波長470nm 和445nm 存在兩個峰,這兩個組分主要是由類腐殖酸熒光所導致的[9,18-19].熒光組分1、2、4 和5 也能夠在秸稈發酵沼液和牛糞稻草混合干發酵沼液中發現[9,20].而組分3 也存在于秸稈發酵沼液DOM 中.這些結果表明,這些熒光組分能夠在不同原料的厭氧發酵沼液中存在.組分C6(component 6)由1 個類色氨酸熒光基團和1 個類腐殖酸熒光基團組成,分別在Ex/Em 為250nm/340nm 和250nm/470nm 處,先前研究的厭氧發酵沼液中并未發現此類結合的熒光組分.

圖1 平行因子模型識別的6 個熒光組分Fig.1 Six fluorescent components identified by PARAFAC model

由圖2 可知,PARAFAC 模型識別的各熒光組分在牛糞發酵沼液DOM 中的熒光強度值.變化由大到小依次為C3＞C2＞C5＞C1＞C6＞C4.組分C3 具有較高的熒光強度值,其熒光物質的相對含量較高,而組分C3 主要以類富里酸熒光物質為主.組分C6 主要是類腐殖酸熒光為主.C1～C6 組分的熒光物質相對含量分別占總熒光物質的15.3%、20.9%、26.0%、8.3%、17.0%和12.5%.盡管組分C3 的所占的比例較高,但類蛋白組分在C3 和C6 中都存在,因此類蛋白組分在沼液DOM 的含量相對較高的,這從先前的研究也能得到證實[2,9].

不同波長處的熒光組分,其熒光物質含量、分子量大小、芳香化合物縮聚程度和腐殖化程度也各不相同,這些都影響Fe(III)的絡合作用和絡合機制,進而影響沼液施用后土壤中Fe(III)離子的形態分布、遷移和轉化過程.通常,熒光物質的結構隨時波長的增加而變得更加復雜,其分子量大小、芳香縮聚程度和腐殖化程度也相對較高[21],而這些具有復雜結構的組分在沼液DOM 中熒光物質的含量相對較低,比如C4 和C6.

圖2 PARAFAC 識別熒光組分的熒光強度值Fig.2 Intensities of fluorescent components identified by PARAFAC model

2.2 Fe(III)與沼液DOM 絡合2D-SYS-COS 分析

為了進一步分析Fe(III)與沼液DOM 熒光物質的絡合機制,二維相關光譜分析用于揭示DOM 熒光組分與Fe(III)離子的絡合優先次序.圖3 結果顯示,同步光譜存在2 個自動峰和1 個交叉峰,自動峰分別在 280nm 和 328nm 處,交叉峰出現在 328nm處.280nm 處的峰主要是由類蛋白熒光物質引起的,328nm 處的峰是由類富里酸峰熒光物質產生的[14],這兩個峰也存在于傳統同步熒光光譜中.二維相關光譜同步峰主要反映熒光組分對外界環境變化的敏感程度,如Fe(III)離子濃度變化.根據Noda 規則[17],熒光組分對Fe(III)離子干擾導致的敏感程度由大到小為280nm→328nm,說明類蛋白熒光物質對Fe(III)離子的濃度變化敏感性更強.

異步光譜顯示存在2 個負交叉峰(灰色),分別在306nm 和334nm 處,306nm 處的交叉峰主要是由類蛋白熒光物質引起的,如類色氨酸熒光[22].而334nm的交叉峰則是由類富里酸熒光物質引起的[23].二維異步光譜反映兩個動態光譜信號的光譜強度變化順序[16-17],表示Fe(III)離子加入后,能夠與Fe(III)離子發生絡合作用的優先順序.因此,圖3 的結果表明,DOM 組分與 Fe(III)離子優先絡合的順序為334nm→306nm,類富里酸熒光組分優先與Fe(III)離子發生絡合作用.

圖3 Fe(III)與沼液DOM 絡合的2D-SYS-COSFig.3 2D-SYS-COS maps of DOM-Fe(III) complexes

圖4為傳統的SYS結合二維相關光譜分析識別的熒光組分的強度變化.由圖可知,在280nm 處的類蛋白熒光物質強度值最高,占42.83%.而306nm 的類蛋白熒光與328nm 和334nm 的類富里酸熒光物質的強度值相差不大,分別占 18.37%、19.50%和19.30%.與PARAFAC 相比,類腐殖酸峰在SYS 和二維相關光譜中并未能被識別,但是類蛋白熒光物質仍然是主要的熒光組分.同時,二維相關光譜分析能夠揭示Fe(III)離子與沼液DOM 熒光組分絡合的優先順序,為理解沼液施用后對土壤中Fe(III)離子的地球化學行為提供指導.

圖4 2D-SYS-COS 識別熒光組分的熒光強度值Fig.4 Intensities of fluorescent components identified by 2D-SYS-COS

2.3 Fe(III)與沼液DOM 絡合2D-FTIR-COS 分析

二維紅外相關光譜也已經廣泛的用于研究DOM 與重金屬的絡合作用,用于解釋DOM 官能團組分與重金屬離子的絡合機理[9,13].圖5 為Fe(III)離子與牛糞發酵沼液DOM 絡合的二維紅外相關同步和異步光譜圖.同步光譜圖主要顯示三個波數段的峰出現,分別在1200～1400cm-1、1400～1600cm-1和1650～1900cm-1處,表明這些波數段的官能團組分對Fe(III)離子的加入具有較高的敏感性.

圖5 Fe(III)與沼液DOM 絡合物的2D-FTIR-COSFig.5 2D-FTIR-COS of DOM-Fe(III) complexes

2D-FTIR-COS 的異步圖顯示,3 個正的交叉峰能夠被識別,分別在1528cm-1、2265cm-1和2771cm-1處.根據文獻可知[24],1528cm-1處的峰為仲酰胺(開鏈)N?H 彎曲振動引起的;2265cm-1處的峰通常為銨鹽引起的,主要為仲銨鹽—NH2,具有寬峰或較肩峰組成的群峰;2771cm-1處的峰不同結構中的—CH2振動所引起的(如R—CH2—NH2).根據Noda 規則,優先順序為2265→2771→1528cm-1,表明DOM 在2265cm-1處的官能團優先與Fe(III)離子發生絡合作用.銨鹽能夠被植物快速吸收,這可以促進Fe(III)離子的植物吸收.

圖5 也顯示9 個負交叉峰,分別在1310cm-1(1310/1149、1310/1116、1310/1093)、1479cm-1(1479/1149、1479/1116、1479/1093)和1805cm-1(1805/1149、1805/1116、1805/1093)處各3 個.1310cm-1處的峰由醇類O—H 內面彎曲振動或胺類C—N 伸縮振動引起的,1479cm-1處的峰主要由脂肪族C—H 振動引起的;1805cm-1處的峰為飽和開鏈酸酐C=O伸縮振動引起的[23].Fe(III)離子與DOM 官能團優先絡合的次序為1310/1149、1310/1116、1310/1093、1805/1149、1805/1116、1805/1093、1479/1149、1479/1116、1479/1093,表明醇類或胺類能夠優先與Fe(III)發生絡合作用.因此,根據Noda 規則,DOM 中能夠優先與Fe(III)發生絡合作用的官能團次序為2265→2771→1528→1310→1805→1479cm-1.

2.4 絡合參數

圖 6 顯示隨著 Fe(III)離子濃度的增加,PARAFAC 模型和2D-COS 分析識別的熒光組分強度逐級降低,表明Fe(III)離子能夠與這些熒光組分發生熒光猝滅作用.而PARAFAC 模型識別的組分猝滅效果明顯要比2D-COS 識別的組分要好.2DCOS 分析識別的熒光組分中類蛋白組分具有較好的猝滅效果.絡合模型包括線性的修正的Stern—Volmer 模型[25]、非線性Ryane—Weber[26]和雙對數模型用于本研究進行絡合參數的計算,結果發現僅雙對數模型能夠獲得較好的擬合效果.因此,本研究采用雙對數模型計算熒光組分與Fe(III)離子的絡合常數及絡合點數量,擬合效果也較好.

圖6 熒光組分與Fe(III)絡合的猝滅曲線Fig.6 Quenching curves of fluorescent components with Fe(III)

表1 結果表明,類蛋白熒光組分C2 具有較低的logK 值,僅為4.34.而類腐殖酸組分C5 的logK 值最高,具有較高對的Fe(III)絡合物化學穩定性.從表1發現,在短波處組分和Fe(III)離子的絡合常數都相對較低,如C1、C2 和C3 的logK 值都明顯低于長波處的組分的logK 值.而組分C6 由于類腐殖酸組分的存在,其logK 值也較高.先前對秸稈發酵液DOM 與Fe(III)的絡合研究表明,類蛋白、類富里酸及低波長處的類腐殖酸與Fe(III)的logK 值較高,為5.81～6.00[9],說明不同發酵原料產生的發酵液DOM 在與Fe(III)離子的絡合上存在差異.同樣,2D-COS 識別的類蛋白組分C280的logK 值明顯要低于類富里酸組分的logK 值,且隨著波長的增加,logK 值呈現增加的趨勢.絡合點的數量結果表明,隨著絡合常數logK 值的增加,絡合點數量也呈現增加的趨勢,即生產高化學穩定性的絡合物熒光物質具有較高的n 值.然而,先前的研究也已經報道[15],雙對數模型計算的n 值存在一定的缺陷,并不能準確反映絡合點的數量,實際上僅僅是希爾系數值,n值通常要比真實絡合點數值低.

由表1 可知,牛糞發酵沼液熒光組分能夠與Fe(III)絡合生成較高穩定性的絡合物.相似的結果在秸稈發酵沼液DOM 與Fe(III)離子的絡合作用中也能發現[9],同時Fe(III)離子與沼液DOM 組分絡合常數明顯要高于其他重金屬,如Cr(III)、Cu(II)和Pb(II).高化學穩定性的DOM-Fe(III)絡合物的生產,有利于增強土壤中Fe(III)離子的溶解性,更利于植物的吸收.而Fe(III)離子是植物生長及光合作用所必需的元素,其化學移動性對植物生長能夠產生重要的影響.此外,化學穩定性高的DOM-Fe(III)絡合物形成也影響了土壤中Fe(III)的形態分布,增加了絡合形態Fe 的含量.DOM-Fe(III)絡合物的形成會影響水或土壤環境中鐵氧化物的水解和沉淀[27],絡合作用的能夠破壞Fe(III)的水解平衡,使得水解平衡反應向左進行.而在水環境中,DOM-Fe(III)絡合物形成能夠抑制DOM 的光化學活性,影響水體中污染物的光化學特性,提高污染物的環境風險[28].此外,DOM與Fe(III)的絡合作用受到其他因素的影響,比如pH值增加促進Fe(III)水解,還原性DOM 對Fe(III)離子的還原作用影響了絡合作用,微生物能夠促進Fe(III)的還原作用,厭氧條件有利于微生物對Fe(III)的還原[29].比如,還原性DOM 沼液施用于水淹環境下,厭氧條件有利于在微生物作用下DOM 將Fe(III)的還原成Fe(II).在旱地環境施用沼液相比于水淹環境更不利于Fe(III)的還原,水淹環境對沼液移動性和濃度都產生影響,不利于沼液與土壤中不同形態Fe(III)的接觸,從而影響了DOM與Fe(III)的絡合作用.因此,沼液作為有機肥施用于土壤后,其DOM 對金屬離子的遷移和轉化過程仍需要進一步的研究.

表1 DOM 熒光組分與Fe(III)的絡合參數Table 1 Binding parameters of DOM fluorescent components with Fe(III)

3 結論

3.1 牛糞發酵沼液DOM 中含有眾多熒光有機組分,如類蛋白、類富里酸和類腐殖酸熒光物質,其中類蛋白熒光組分在DOM 中的含量較高.類蛋白熒光組分與Fe(III)的絡合物穩定性較低,類富里酸和類腐殖酸熒光物質與Fe(III)能夠形成高化學穩定性的絡合物,如熒光組分C2 的logK 值僅為4.34,而腐殖酸組分C5 的logK 值高達7.03.熒光組分的含量及其與Fe(III)離子絡合形成不同穩定性的絡合物,能夠影響Fe(III)離子在環境中的形態分布及遷移轉化過程.

3.2 類蛋白熒光組分對Fe(III)濃度變化更敏感,但類富里酸組分能夠優先與Fe(III)離子發生絡合作用,并形成較穩定的絡合物.同時,2D-FTIR-COS 能夠識別12 個基團參與Fe(III)的絡合,仲銨鹽—NH2基團能夠優先與Fe(III)離子發生絡合作用,可以促進Fe(III)離子的植物吸收.沼液DOM 與Fe(III)的絡合作用研究能夠為沼液施用土壤后Fe(III)的形態分布、氧化還原和遷移轉化過程提供理論依據.