土壤微生物電化學系統降解四環素的機理

趙曉東,李曉晶,趙鵬宇,宋敏麗,燕平梅,任天志,李永濤,3 (.農業農村部環境保護科研監測所,農業農村部產地環境污染防控重點實驗室,天津市農業環境與農產品安全重點實驗室,天津 3009；.太原師范學院生物系,山西 榆次03069；3.華南農業大學資源環境學院,廣東 廣州 5064)

近年來,抗生素在畜禽養殖業的濫用[1-2],以及其在動物體內的難以吸收性(排泄率達40%～90%)[3],導致抗生素在動物糞便中具有極高的檢出率和殘留量[4].畜禽糞肥農用造成了農業土壤中嚴重的抗生素污染,尤其是四環素在土壤中的含量高達0.16～10967ng/g[5].近期研究發現,土壤中的四環素及其抗性基因(ARGs)會通過食物鏈傳播,從而對人類健康造成威脅[6-8].

微生物修復作為一種綠色、環境友好型的修復技術在土壤污染治理過程中起著關鍵的作用[9].隨著有機污染物的氧化降解,污染土壤中氧化劑(電子受體)逐漸消耗以致缺乏限制了微生物的修復效率,而土壤微生物電化學系統(SMES)能夠提供固體陽極作為永不枯竭的電子受體,在將土壤中有機污染物降解的同時還能將此過程中的化學能直接轉化為生物電能,既解決了微生物修復效率提升的技術瓶頸,又實現了污染治理與固廢資源化利用的雙功效,且該過程無二次污染[10-12].

最新的研究表明,運用微生物電化學系統(MES)可以高效地去除水體中殘留的四環素類抗生素,雖然MES 對ARGs 的抑制效能仍存在一定爭議,但四環素類抗生素的去除率在7d 內較對照處理可提高70%～125%[13-17].為了進一步明確MES 在四環素污染修復中的應用前景,本文前期研究首次將MES 應用至四環素污染土壤中,研究發現相比于黑土、紅壤和黃棕壤,SMES 更適用于潮土,四環素降解率較對照可提高39%[18],且ARGs 豐度較對照下降了28%～47%[19].土壤酶是土壤重要的組成成分,主要來源于微生物和植物根系的分泌,它不僅能夠有效驅動土壤的養分循環,而且還是土壤有機污染生物修復過程中的重要物質[20].但SMES 是如何調控微生物分泌功能酶從而促進四環素的降解效能仍有待深入研究.因此,本文旨在探明SMES 運行過程中四環素降解-酶活性-微生物之間的內在聯系,以期揭示該技術對四環素的生物降解機理.

1 材料與方法

1.1 供試土壤

本研究的供試土壤為潮土,采自天津武清區(N39°27′20.59″, E117°09′26.18″).將采集的土壤在陰涼通風處自然風干,研磨并過2mm 篩保存備用,其基本土壤理化性質見表1.

表1 供試土壤的基本理化性質Table 1 The physicochemical properties of experimental soils

1.2 反應器構型與操作

本研究選取了活性炭空氣陰極和碳纖維布陽極的單室反應器構型(體積為6cm×6cm×9cm),如圖1(a),活性炭空氣陰極的制作方法參照課題組先前的報道[21].為了降低土壤內阻,增強SMES 的電子傳遞效率,向土壤中摻入質量比為1%(以干土計)的碳纖維絲(長1cm)[22].碳纖維布與碳纖維絲在使用之前均用丙酮浸泡過夜后用蒸餾水沖洗3～5 次備用.反應器填裝的土量為300g,將120mL 的蒸餾水加入土壤與碳纖維絲一起攪拌均勻置入反應器中,并在反應器土壤表層加約1cm 厚的蒸餾水作為水封層以阻隔氧氣的入侵.

圖1 土壤微生物電化學系統構型和采樣方案示意Fig.1 The construction of soil microbial electrochemical system and the sampling scheme of the experiment

表2 實驗設計Table 2 The experimental design

本試驗共設兩組:第一組為四環素染毒組(染毒濃度為5mg/kg),第二組為不添加四環素對照組.每組包含2 個閉路處理,一個開路對照和一個無電極對照.所有處理均置于恒溫培養箱在30℃的條件下暗室培養,試驗周期為58d.試驗結束后拆反應器取樣,取樣部位(圖1b)分別設定在陰極表面向上1cm以內的區域(C 層)、陽極表面上下各0.5cm 的區域(A層)和從土壤表層向下1cm以內的區域(S層).實驗方案具體如下(表2):

1.3 測試方法

土壤pH 值和電導率的測定方法參照課題組先前報道的文獻[23]:稱取2g 冷凍干燥后的供試土壤倒入50mL 離心管中,按照土水比1:5 加入10mL 去離子水,在渦旋儀上以2500r/min 的轉速振蕩30min使土水充分混勻,用超高速離心機以10000r/min 的轉速離心7min,收集上清液后用pH計和電導率儀測定土壤的pH 值和電導率.

采用土壤酶試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司)測定土壤脫氫酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶和漆酶的活性,前處理方法根據試劑盒提供的說明書進行.分別在485nm、430nm、240nm 和420nm 波長處使用紫外分光光度計測定土壤脫氫酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶和漆酶活性[23-25].

此外,土壤中四環素殘留量和微生物群落(包括細菌、真菌和古菌)的測定方法參見本文前期研究成果[19].

1.4 數據分析與統計

Network 圖用于分析四環素降解、脫氫酶活性和三域微生物之間的關系,所用軟件為Cytoscape 3.7.0.為了增強Network 圖的可讀性,首先借助IBM SPSS Statistics 2.2 軟件對四環素降解、脫氫酶活性和三域微生物之間做Spearman 相關性分析,篩選出達顯著正相關(P＜0.05)的兩兩關系進行作圖.Network 圖中的節點代表四環素降解、脫氫酶活性或者微生物,連接節點的邊代表兩節點之間的關系[26].采用Canoco5.0 軟件進行冗余分析,采用Office 2007、Origin 2019 等軟件進行數據分析和作圖,采用IBM SPSS Statistics 2.2 軟件進行組間差異分析.

2 結果與討論

2.1 四環素在不同處理中的降解率

四環素在TC 處理展現出最高降解率(70%),在TO 處理中次之(66%),它們較在TN 處理中的降解率分別提高35%和27%(P＜0.05,圖2),表明SMES 可有效提升土壤中四環素的去除效率[19].從不同土層角度來看,四環素在閉路和開路A 層的降解率最高,其次為C 層,均比閉路和開路處理相應的S 層高出約8% (P＜0.05).

四環素在環境中的降解途徑主要包括非生物降解和生物降解,其中非生物降解主要包括光解、氧化降解和水解等[27].在本研究中,整個試驗過程均在避光條件下進行,且未添加任何氧化劑.同時,所有處理均處于淹水條件,理論上各處理對四環素的水解能力一致.因此,非生物降解并不是SMES 促進四環素降解的主要途徑.相比之下,該系統能提供生物電流刺激微生物的代謝活性,從而強化對污染物的生物降解效率[28-29].因此,認為本研究中生物降解是SMES 提升四環素降解效率的主要方式.

圖2 四環素在不同處理中的降解規律Fig.2 Degradation rate of tetracycline in different treatments

2.2 不同處理中土壤pH 值和電導率的變化

經過58d 的實驗周期,土壤pH 值展現出規律性的變化(圖3a).與原始土壤OS(7.72±0.02)相比,閉路處理的pH 值呈現出一定的降低趨勢,而無電極處理則呈現升高趨勢.例如TC 處理較OS 處理pH 值降低了0.14 個單位(P＜0.05),而CN 處理較OS 增加了0.17 個單位(P＜0.05).土壤pH 值在不同處理的變化趨勢與氧化還原電位有關,通常情況下土壤氧化還原電位每下降59mV,pH 值會相應增加一個單位,這是因為土壤從氧化態向還原態轉變時會消耗土壤中的氫離子,氫離子的消耗直接引起了土壤pH 值的增加[30].而據前人研究表明,SMES 的氧化還原電位顯著高于無電極對照[31].同時,SMES 不同層之間比較發現,土壤pH 值在陰極(C 層)明顯高于陽極(A層)(圖3c),這與前人的研究一致,這是因為陰極表面反應消耗H+引起OH-的積累而導致pH 值在陰極升高,而同時陽極附近會產生H+降低pH 值[11-32].

與不添加四環素的處理相比,添加四環素處理的土壤電導率有明顯增加,且電導率在閉路系統中進一步被提高(圖3b).在閉路系統中,與相應的陽極附近(A 層)相比,陰極附近(C 層)和表層(S 層)的電導率在TC 處理中增加了38%～45%,在CC 處理中增加了30%～47%(圖3d).開路處理與閉路處理展現出相同的趨勢.而在無電極處理中,土壤電導率從S 層至C 層逐漸降低.例如,在TN 處理中,S 層的電導率較A層和C 層分別高出42%和73%.分析原因,第一,鹽離子隨著水分的蒸發而逐漸擴散至土壤表層(S 層),因此所有處理S 層的電導率均高于A 層;第二,閉路和開路處理陰極附近土壤電導率高于陽極的原因可能是水分會通過陰極蒸發或者生物電場驅動從而帶動鹽離子的遷移[33].

圖3 不同處理土壤pH 值和電導率的變化Fig.3 Change of soil pH value and conductivity in different treatments

2.3 不同處理中土壤酶活性的變化

與OS 處理相比,土壤脫氫酶活性在CN 處理中下降了53%(P＜0.05),添加四環素(TN 處理)進一步降低了脫氫酶的活性,降幅達38%(圖4a).而與TN處理相比,電極引入(TO 處理)后脫氫酶活性增加了126%(P＜0.05),且脫氫酶活性在閉路處理(TC 處理)中被進一步提高.脫氫酶可以在一定程度上反應土壤中微生物的降解活性狀況,說明在生物電流的不斷刺激下,微生物的新陳代謝得到了強化,進而有利于對四環素的降解[34].由圖5a 可知,脫氫酶活性在TC 和TO 處理的陽極區域最高,這與四環素降解率的趨勢一致(圖2).

與土壤脫氫酶活性趨勢相似,各處理的土壤多酚氧化酶活性也在實驗結束后呈現出不同程度的降低,降幅達16%～34%(P＜0.05,圖4b).與不加四環素處理相比,多酚氧化酶活性在添加四環素處理中降低了8%～19%.此外,雖然土壤多酚氧化酶活性在不同土層之間沒有規律性的變化,但在添加四環素處理中的陽極受到明顯的抑制(圖5b).多酚氧化酶作為典型的氧化還原酶可以促進芳香族化合物的降解轉化,前人研究結果也發現土壤多酚氧化酶的活性會受到四環素的抑制,這意味著該酶在四環素降解過程中的作用相對較小[20].

土壤過氧化氫酶是評價污染土壤毒性狀況的指示酶[35],本研究中土壤過氧化氫酶活性主要受到四環素的抑制(圖4c).例如,與原始土壤相比,過氧化氫酶活性在未添加四環素處理(CN、CO 和CC 處理)并沒有顯著的變化,而當過氧化氫酶暴露在四環素環境(TN、TO 和TC 處理)后,其活性顯著降低了16%～21% (P＜0.05),這與前人的研究結果一致[36-38].同時,過氧化氫酶活性在添加四環素閉路處理的C層和A層較相應的S層顯著提高了17%～26% (P＜0.05,圖5c),這與四環素在TC 處理S 層較高的殘留濃度一致.

圖4 不同處理間土壤酶活性變化Fig.4 Change of soil enzyme activities in different treatments

圖5 各處理不同層間土壤酶活性的變化Fig.5 Change of soil enzyme activities in different layered soils

漆酶是一種具有廣譜性降解能力的含銅多酚氧化酶,它能夠將環境中的酚類化合物催化為醌類物質或苯氧自由基[39-40].由圖4d 和圖5d 可知,與OS相比,土壤漆酶活性在實驗處理中受到明顯的抑制,且在添加四環素后其活性進一步被降低,這表明漆酶更偏好于好氧降解過程.

2.4 環境因子與微生物群落的冗余分析

采用冗余分析以探明四環素降解、土壤pH 值、電導率、酶活性與主要的屬水平微生物群落(包括細菌、真菌和古菌)之間的關系(圖6).微生物群落在不同處理中的變化規律參見文獻[19],相關數據已上傳至NCBI 數據庫(SUB5067487, PRJNA516294).由圖6 可知,兩排序軸的總解釋度達80.48%,實線-空心箭頭代表解釋變量(包括四環素降解、土壤pH 值、電導率、酶活性),虛線-實心箭頭代表響應變量(包括屬水平的細菌、真菌和古菌群落).本研究中,解釋變量共同解釋了96.4%的樣本信息,其中土壤pH 值對響應變量的解釋度達到顯著水平(解釋度為21.5%,P＜0.05),說明pH 值是影響微生物群落結構的重要指標.如圖6 所示,pH 值與四環素降解呈負相關關系,這意味著四環素可能在偏酸性條件下更容易被降解.由圖還可知,四環素的降解率與土壤脫氫酶活性呈正相關關系,進一步通過Spearman 相關性分析發現,兩者之間達極顯著水平(r=0.95, P＜0.01).Leng等[41]研究指出,四環素的生物降解途徑主要包括脫甲基、脫氫、脫羰基和脫氨基等過程.因此,在本研究中脫氫酶在四環素的脫氫過程中很可能起到了重要的作用.此外,數量過半的屬水平微生物與四環素降解和脫氫酶呈現出緊密相關關系,如Bacillus、Desulfocapsa 、 Scedosporium 、 Microascus 、Wardomyces 、 Aphanoascus 、 Chaetomium 、Aspergillus、Scopulariopsis、Geoalkalibacter 等.

圖6 土壤微生物群落與環境因子的冗余分析Fig.6 Redundancy analysis between soil microbial community and environmental factors

產電呼吸是SMES 去除污染物質的重要機制,在陽極,污染物作為電子供體被生物氧化產生質子(H+)和電子(e-),而H+和e-在胞內外的轉移速率將會決定污染物的去除效率[42].在呼吸鏈的氧化還原過程中,脫氫酶會參與代謝中間產物之間的H+轉移并產生電位差,這將有利于生物電能的產生[43].在本研究中,脫氫酶活性的增加一方面可能會提升H+的轉移速率從而促進四環素的去除效率;另一方面,由H+轉移導致的電勢差提升了系統的電能輸出,這再度刺激了降解菌的代謝活性最終進一步提升了對四環素的生物降解效率.

2.5 四環素的潛在降解功能菌

為了進一步探明脫氫酶的潛在分泌菌,并揭示四環素的潛在降解微生物,通過Network 關聯分析對四環素降解率、脫氫酶活性和微生物群落之間的關系做了進一步分析(圖7).由圖可知,屬水平微生物Microvirga 、 Staphylococcus 、 Lachnospiraceae NK4A136group、Geoalkalibacter、Microascus、Wardomyces 、 Aspergillus 、 Aphanoascus 和Scopulariopsis 與四環素降解之間存在較密切的聯系.其中,細菌變形菌門地桿菌科中Geoalkalibacter,真菌子囊菌門小囊菌科中Microascus、Wardomyces和 Scopulariopsis,以及同門 Onygenaceae 科中Aphanoascus 的豐度隨四環素的添加而增加,并在電極的引入和生物電流的刺激下被進一步提高[19].以Geoalkalibacter 和Microascus 為例,與無四環素對照(CN 處理)相比,它們的豐度在添加四環素后(TN 處理)分別增加了42%和50%,引入電極后(TO 處理)其豐度分別進一步增加了152%和90%,在生物電流的刺激下(TC 處理)分別再度提高了7%和32%[19].

圖7 四環素降解率、脫氫酶活性和屬水平微生物之間的Network 分析Fig.7 Network analysis showing the connectedness among tetracycline degradation, dehydrogenase activity and microbial abundance at genus level

Geoalkalibacter 是常見的電活性微生物,通常富集于SMES 的陽極區域參與產電過程[44-45].Hamdan等[46]研究表明,Geoalkalibacter 的存在更有利于多環芳烴的降解,這可能是因為Geoalkalibacter 促進了SMES 的產電性能,降解功能微生物的活性受到生物電流的刺激后進一步促進了污染物質的降解.先前研究表明,Microascus 可促進有機物質的降解[47], Microascus 和Wardomyces 在異丙甲草胺污染土壤中的富集證明了它們在降解異丙甲草胺過程中的重要作用[48].同時,Scopulariopsis sp.在五氯苯酚污染土壤中起到了生物修復和生物防治的雙重功效[49].以上證據表明,Geoalkalibacter、Microascus、Wardomyces和Scopulariopsis在本研究中可能參與四環素的降解,且真菌子囊菌門中的小囊菌科在此過程中起到了主要的降解作用.由圖7 還可知,脫氫酶活性與屬水平真菌Microascus 和Scopulariopsis 之間關系密切,表明Microascus和Scopulariopsis很可能通過分泌脫氫酶從而促進了四環素的脫氫過程.

3 結論

3.1 SMES 能夠有效去除土壤中殘留的四環素,其降解率較無電極對照增加35%(P＜0.05).土壤脫氫酶活性在染毒開路和閉路處理中呈現出顯著的升高趨勢,且與四環素降解率呈顯著正相關關系,而土壤過氧化氫酶活性受到四環素的顯著抑制.

3.2 Geoalkalibacter、Microascus、Wardomyces 和Scopulariopsis 是四環素的潛在降解菌,相比于細菌和古菌,真菌子囊菌門中的小囊菌科發揮了主要的四環素生物降解作用.其中,Microascus 和Scopulariopsis 很可能通過分泌脫氫酶從而促進了四環素的脫氫過程.

3.3 土壤pH 值是影響微生物群落結構的重要理化指標,且與四環素降解呈負相關關系,這意味著四環素可能在偏酸性環境中更易被降解.