同化和共代謝降解氯苯菌株的篩選與特性研究

郭江楓,邢志林,王永瓊,曹 昆,張學煉,茍 芳,石云椿,劉莉莎,趙天濤 (重慶理工大學化學化工學院,重慶 400054)

氯苯(CB)是重要的有機溶劑和化工生產中間體,廣泛應用于有機合成、醫藥、農藥、制革等工業生產[1-3],導致CB 污染遍布全球,甚至南極大陸和北極積雪中均有檢出[4-6],其化學性質穩定,揮發性強,已成為水、土壤、沉積物和大氣環境中最普遍、最嚴重的氯代有機污染物之一[7-10].CB 已被美國環境保護署(USEPA)納為優先控制污染物,其持久性和毒性作用對人類和生態環境構成了嚴重威脅,如何有效實現環境中CB 的去除已成為氯代有機污染物降解領域研究的熱點.

研究者提出了許多物化法去除環境中CB,包括吸附[11]、化學氧化[12]、光化學氧化[13]、電化學[14]、等離子體[15]等.這些方法往往需要大量能量,且價格昂貴,無法進行廣泛應用.與物化法相比,生物法具有耗能小、反應條件溫和、處理成本低和二次污染小優勢,在CB 降解中具有重要的應用潛力.CB 結構穩定,其生物降解性能依賴高效微生物菌株,國內外針對功能菌株分離已開展多年研究,已分離的能夠降解CB 的純菌株包含了十幾個菌屬,模式菌株主要有紅球菌屬(Rhodococcus)[16],伯克菌屬(Pandoraea)[17],皮氏羅爾斯通菌屬(Ralstonia)[18],葡萄球菌屬(Planococcus)[19]和芽孢桿菌屬(Bacillus)[20].已分離菌屬主要來自于污染的土壤、泥漿和水體沉積物,CB 降解率約為70%～93.4%[21-23].CB 降解菌的分離純化盡管已開展多年,但由于菌株的耐受濃度低,環境適應能力差,可用于環境中CB 修復的菌株還十分有限[24],已分離的功能菌株對CB 耐受性普遍低于150mg/L,CB 代謝速率為0.56～1.33mg/(L·h)[25-27],難以滿足大規模應用的需要.挖掘高效CB 降解的生物資源一直是該領域關注的重點.

研究表明,厭氧條件下CB 可通過還原脫氯途徑發生轉化,但該過程CB 生物降解往往十分緩慢,且易形成致死及二次污染物[28];好氧條件下CB 可作為某些微生物的生長底物,為微生物提供碳源和能源發生轉化;此外,好氧條件下CB 也可被微生物通過共代謝途徑實現轉化.與厭氧降解相比,CB 的好氧生物轉化具有降解速率快,礦化徹底等優勢,更適合環境原位生物修復應用[29],CB 好氧轉化是當前關注重點.污染場地環境中氧化還原電位、有機質含量(生長底物)等的時空分布差異很大,而已分離的微生物對CB 降解往往只能通過一種途徑,這進一步限制了單一功能菌株的應用范圍[30].因此,篩選具有高耐受和廣泛適應能力的CB 降解菌株,開展降解特性研究,對CB 污染場地的原位生物強化具有重要的理論和現實意義.

基于此,本研究基于CB 污染土壤篩選功能菌株并進行系統發育分析,考察CB 為底物條件下菌體的生長特性、CB 的耐受濃度和降解特性,及不同底物條件下CB 的共代謝降解特性,并分析了環境因子對菌株降解CB 的影響.研究結果將豐富CB 降解功能菌生物庫,并為CB 類有機污染物的原位修復提供重要支撐.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

污染土壤采自重慶市大渡口區原重慶鋼鐵股份公司動力廠五萬立方煤氣柜周邊污染土壤(106°29′20″E,29°28′30″N),該場地是上世紀40 年代配套型鋼廠生產而建設,在2010 年隨著重鋼的搬遷逐步停產,該土壤污染物主要包括鉛、鎘等重金屬,C3～C35 類石油烴及CB、五氯苯(PeCB)等氯代芳烴.污染土壤取4mm 篩下和2mm 篩上顆粒.

1.2 培養基配制

無機鹽培養基:CaCl20.1g,MgSO4·7H2O 0.4g,NH4Cl 2.02g,KH2PO43.0g, Na2HPO4·12H2O 17.7g,NaCl 0.5g,蒸餾水1L,pH 值:6.5～7.0.

LB 培養基:酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,蒸餾水1L.

選擇性培養基A:酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,蒸餾水1L,一定濃度的CB(阿法埃莎(天津)化學有限公司,分析純),pH 值:6.5～7.0(固體培養基+1.5%～2.0%的瓊脂).

選擇性培養基B:CaCl20.1g,MgSO4·7H2O 0.4g,NH4Cl 2.023g,KH2PO43.0g,Na2HPO4·12H2O 17.7g,NaCl 0.5g,蒸餾水1L,一定濃度CB(固體培養基+1.5%～2.0%的瓊脂).培養基所需藥品來自于成都市科龍化工試劑廠,分析純.

1.3 菌株的分離與鑒定

取污染土壤10g,置于裝有100mL 去離子水的250mL 的錐形瓶中,在30℃、160r/min 的搖床中充分振蕩3h.靜置20min 后取上清液10mL 接種于裝有100mL LB 培養基的250mL 錐形瓶中,同樣條件培養72h.保存作為種子液.

取富集后種子液5mL 加入到裝有50mL 選擇培養基B 的125mL 血清瓶中,分別加入60,130,200mg/L 的CB,置于30℃、160r/min 搖床中培養.3d 后,取5mL 菌液接種選擇培養基A 中,相同條件培養.以相同方式連續4 次傳代培養,過程中連續監測OD600和CB 濃度變化.

將所獲得混合菌進行梯度稀釋,將稀釋梯度為10-3、10-4和10-5的菌液涂布在選擇性固體培養基B 中,CB 濃度為200mg/L,置于30℃的恒溫培養箱中培養,觀察到肉眼可見的菌落長出,挑取生長較快、個體較大的單菌落進行多次平板劃線,直到得到單一菌株.將純化菌株接種到以CB 為唯一碳源的液體培養基B 中傳代培養.以上均要在無菌操作臺中進行.

將純化后的菌株在固體培養基上進行劃線培養,待長出單個菌落后進行形態觀察并進行革蘭氏染色.取上 述細菌培養液 1～5mL 用 Mobio PowerSoil? DNA Isolation Kit 試劑盒提取樣品中微生物總基因組 DNA,并利用通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對細菌16S rRNA基因進行PCR 擴增.25 μL 擴增體系為:DNA 模板1 μL,1.1×T3Super PCR Mix22mL,27F (10μmol/L)和1492R (10μmol/L)各1 μL.PCR 擴增程序為:98℃3min;98℃ 10s,58℃ 10s,72℃ 10s,30 個循環;72℃2min.獲得的PCR 產物取5μL 進行3%瓊脂糖凝膠電泳,使用切膠回收目的片段進行DNA 測序,DNA 的測序委托四川擎科生物公司完成.降解菌16S rRNA基因序列通過BLAST 程序與GenBank 中核酸數據進行比對分析.利用MEGA 7.0 軟件[31]進行聚類分析,設置Bootstrap 值為1000,采用Neighbor-joining法進行系統發育分析.

1.4 菌株生長曲線的測定

1.5 菌株對CB 的降解實驗

1.5.1 同化降解實驗 無菌條件下,功能菌株接種到含選擇性培養基A 中,在30℃、160r/min 條件下培養5d,4000r/min 離心10min,去除上清液,用無機鹽培養基(已滅菌)重懸,重復上述步驟2次,最終OD600=0.7.以此菌懸液為初始接種物.以CB 為唯一底物,設置培養基中CB 濃度為60～200mg/L,取2.5mL 上述菌懸液接種培養基中,30℃、160r/min 振蕩培養,設置接種滅活菌液為對照組,所有組別一式3 份,每隔24h 取樣,檢測菌體生長和CB 濃度變化情況.

1.5.2 共代謝降解實驗 以檸檬酸鈉和琥珀酸鈉為生長底物,濃度為4g/L,CB 為共代謝底物,CB 濃度為20～160mg/L.不同體系中接種對數期的菌懸液,使初始OD600達0.1 左右,聚四氟乙烯呂塞密封后于160r/min、30℃的搖床中培養,檢測CB 濃度和菌體濃度變化情況.

1.5.3 環境因子影響試驗 設置單因素實驗,分別考察共代謝條件下溫度(20,25,30,35,40℃),pH 值(4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0)和接種量(1%,2.5%,5%,7.5%,10%)對菌體生長及CB 降解的影響.在50mL 已滅菌的無機鹽培養基中加入CB 以及0.2g 的檸檬酸鈉作為碳源,并接種培養至對數生長期的菌懸液,使初始OD600達到0.1 左右,具塞密封后置于不同條件下培養,檢測單一變量條件下菌體濃度和CB 濃度變化情況.

式中:η為CB 降解率;c0和ct分別表示CB 的初始濃度和t 時刻CB 濃度,mg/L;V0和Vt分別表示溶液初始體積和t 時刻液體體積mL.

式中:VCB為CB 降解速率mol/(gcell·h);t 為時間,h;mcell為菌體濃度,mg/L;

式中:Scell表示細胞平均增長速率gcell/(molCB·h);ct'、c0'表示t 時間和初始時細胞的濃度,mg/L;Vt'、V0'分別表示t 時刻和初始時刻培養基體積,mL;

式中:c1,CB,0、c1,CB,t分別表示CB 初始濃度和第t 時刻CB 濃度,mg/L;k1,CB為CB 的降解速率常數.

1.6 分析檢測

CB 濃度的測定:采用氣相色譜(重慶川儀分析儀器有限公司,SC-8000)定量分析氣相中CB 濃度,色譜柱為不銹鋼色譜柱GDX04 2m;氣相色譜條件:進樣器溫度、柱溫和ECD 檢測器溫度分別為80,120和200 ℃;氮氣為載氣,載氣流速為40mL/min;尾吹氣速為 10mL/min;進樣量為 0.5mL;基流補償為0.00nA.

菌體濃度的測定:采用752 型紫外/可見分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司),在600nm波長下測定菌體的吸光度(OD600).

數據用Excel 2016 軟件統計和分析,origin 9.0做圖.最大比生長速率(μmax,h-1)通過內插法計算.

2 結果與討論

2.1 CB 降解菌的分離與鑒定

以CB 為唯一底物對菌液進行平板劃線,經多次分離純化,獲得能以CB 為碳源和能源生長的菌株.該菌株在選擇性固體培養基上培養3d 后,菌落呈圓形,乳白色或粉紅色,菌落直徑0.5～0.8mm,長0.9～2.0mm(圖1(a));電鏡掃描顯示該菌株為短桿狀,菌體長為1.0～1.5μm,直徑為0.6～0.8μm,經革蘭氏染色顯示為陰性(G-).將菌株的16sRNA 基因序列通過NCBI BLAST 與GenBank 對比,構建基于16S rRNA基因的系統發育樹,結果如圖1(c)所示.比較發現該菌株與粘質沙雷氏菌Serratia sp. strain RJ-10-16、Serratia sp. strain RJ-10-14、Serratia marcescens strain AG2105、Serratia sp. strain KUJM3、Serratia marcescens strain DAP32 等菌株的同源性為99%,該菌株與CB 降解菌Escherichia sp. strain hermanii 同源 性 較 近, 與 Ralstonia pickettii strain L2 、Pseudomonas sp. JS6 和Labrys portucalensis strain F11 同源性相距很遠,將其命名為Serratia marcescans TF-1(保藏號:M 2019674,專利號:201911162719.4).現有已報道的同類菌株可用于降解五氯酚[32]、氰化物[33]、甲硫磷[34]和柴油[35]等的物質,本文中分離的菌株是首次發現的具有CB 降解功能的沙雷氏菌.對TF-1 進行生長曲線的測定,通過Boltzmann 方程模擬確定了TF-1 菌株的生長模型(圖1(d)).該菌在0～20h 生長較慢,20h 之后迅速進入生長期,說明該菌能夠較快的適應生長環境,70h 進入穩定期.在菌株培養50h 后,菌株的OD600達到約1.0,擬合得到最大比生長速率(μmax)為0.04h-1(R2=0.987).

圖1 TF-1 的菌落形態及生長曲線Fig.1 Colony morphology of strain TF-1 and construction of phylogenetic tree

分別以CB、葡萄糖、乳糖、乙酸鈉、琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、乙醇和苯酚為唯一碳源考察了TF-1 的底物范圍,結果如表1所示.以葡萄糖為底物時,TF-1生長情況最佳,OD600值最大為0.52±0.031;其次以琥珀酸鈉和檸檬酸鈉底物時,TF-1 最大OD600值為0.37～0.49.以CB 和乳糖為底物時,TF-1 生長減緩,OD600的最大值為0.23～0.3,表明功能菌TF-1 對其利用難度較大.以苯酚和乙醇為唯一碳源時,功能菌TF-1 無增長,可能是因為苯酚的特殊結構以及乙醇的滅菌功能使得TF-1 對其難以有效的代謝,導致TF-1 無生長[36].

表1 Serratia marcescans TF-1 對不同碳源的利用情況Table 1 Growth of Serratia TF-1on Different Carbon Sources

2.2 TF-1 同化降解CB

圖2 以CB 為底物TF-1 的生長及CB 濃度變化曲線Fig.2 CB as substrate TF-1growth and CB concentration change

與其他生物降解方式相比,同化降解可直接將污染物轉化為無機物,優勢顯著.考察以CB 為唯一底物TF-1 的生長情況及對其降解特性.不同CB 濃度下TF-1 的生長如圖2(a)所示.實驗條件下,TF-1 在所有濃度上均能生長,前4d 生長緩慢,OD600增加緩慢,第5d 進入對數期,最大比生長速率為0.015～ 0.42h-1,細胞平均增長速率為0.0063～0.022gcell/ (molCB·h). CB 剩余率隨時間變化如圖2(b)所示,空白組中CB 剩余率幾乎無變化,實驗組中CB 剩余率隨時間逐漸減小,表明CB 被菌株消耗,相同時間內,CB 濃度越大,剩余率越大.CB 的降解特性參數如表2 所示.隨著CB 濃度增大,CB 降解速率(VCB)逐漸減小,變化范圍為1.35～4.47mol/(gcell·h),是當前已報道CB 降解速率的2 倍[21].隨cCB增大,CB 降解能力下降, TF-1 對低濃度CB 利用率更高,表明CB對TF-1具有毒性作用;而最高菌體濃度無顯著性差異,在cCB為200mg/L 的降解率仍有41.6%,表明該菌株具有高的CB 耐受性.

表2 CB 同化降解特征參數Table 2 Characteristic parameters of CB assimilation degradation

2.3 共代謝條件下CB 的生物轉化

實驗發現以葡萄糖和乳糖為底物時,無CB 降解,本文以琥珀酸鈉和檸檬酸鈉為底物考察了CB 的共代謝降解特性,結果如圖3所示,與僅以CB為唯一碳源相比,琥珀酸鈉和檸檬酸鈉作為底物促進TF-1 生長.以琥珀酸鈉為底物,cCB＜60mg/L 時,對TF-1 生長的影響微弱;cCB＞80mg/L 時,TF-1 生長顯著抑制;以檸檬酸鈉為底物,cCB＜100mg/L 時,對TF-1 生長影響較小;cCB＞120mg/L 時,TF 生長受到抑制,表明檸檬酸鈉為底物TF-1 的耐受性更高.最大比生長速率μmax隨cCB的變化如圖3(e)所示,cCB＜80mg/L 時,μmax(檸檬酸鈉)(0.21～0.87h-1)＞μmax(琥珀酸鈉)(0.20～0.81h-1), cCB＞80mg/L時,μmax(檸檬酸鈉)(0.086～0.21h-1)＜μmax(琥珀酸鈉)(0.17～0.25h-1),說明在低CB 濃度下,檸檬酸鈉為底物促進作用較強,在高CB 濃度下,以琥珀酸鈉為底物更有優勢,總體上μmax隨著CB 濃度的升高而降低,說明功能菌TF-1 受到CB 的毒性作用增強.

共代謝條件下,CB 剩余率隨時間變化如圖3(b)、3(d)所示,其降解趨勢基本相同,在cCB＜20mg/L時,CB 的抑制毒性較小,5d CB 去除率為98%,隨著cCB升高,CB 剩余率也逐漸升高, cCB為40～60mg/L時,CB 剩余率為20%左右,當cCB＞80mg/L 時,CB 的降解影響較小,5d后CB剩余率基本維持在40%左右,分析原因可能是檸檬酸鈉和琥珀酸鈉均為小分子有機碳源,誘導TF-1 產生相關酶的能力相近[37].

TF-1 對CB 的降解符合一級動力學反應.動力學常數k 隨cCB的變化如圖3(f)所示.一階動力學常數基本維持在6.8～13.9h-1之間.CB 降解率隨cCB的變化如圖3(g)所示.不同底物條件下,隨cCB增大,CB降解率變化趨勢相同,均隨濃度增大而降低;cCB相同時,檸檬酸鈉為底物的降解率略高(不超過5%).VCB隨cCB的變化如圖3(h)所示.cCB＜80mg/L 時,VCB(檸檬酸鈉)(0.15～0.47mol/(gcell?h))＜VCB(琥珀酸鈉)(0.17～0.48mol/(gcell?h)),cCB＞80mg/L 時,VCB(檸檬酸鈉)(0.61～1.11mol/(gcell?h))＞VCB(琥珀酸鈉)(0.56～0.95mol/(gcell?h)),表明在低濃度CB 污染時,琥珀酸鈉為底物更利于CB 的降解,高濃度CB 污染時,檸檬酸鈉為底物則更佳.共代謝降解速率受生長底物和共代謝底物濃度比的影響,該研究表明最適生長底物/共代謝底物濃度比受底物種類的影響.

圖3 TF-1 對CB 的共代謝降解特性Fig.3 Co-metabolic degradation properties of TF-1on CB

2.4 CB 生物降解的影響因素

溫度、pH 值和接種量是微生物生長和有機物降解的重要影響因素,考察了3 個因子對TF-1 生長及CB降解的影響.溫度對TF-1的生長及CB降解的影響如圖4所示.由圖4(a)可知,15℃條件下,4d內微生物幾乎無生長,在20～35℃內,微生物均能生長,30℃ TF-1 生長速率最快,48h 達到穩定期.一定范圍內溫度升高,可促進微生物活性,但溫度過高也會使酶活降低甚至失活,當溫度達到40℃時,TF-1幾乎無生長.綜上,TF-1在20～35℃溫度范圍內生長良好,最適生長溫度為30℃ .

圖4 溫度對TF-1 的生長及CB 降解的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth of TF-1and the degradation of CB

與生長情況類似,15℃時,由于TF-1 無生長,4d內cCB無顯著變化;20～35℃范圍內, cCB均有所下降,30℃時濃度下降最快(圖4b),30℃時降解率和VCB最大,分別為93.7%和0.47mg/(L·h) (圖4c),表明TF-1對CB 的最適共代謝降解溫度為30℃ .不同溫度條件下VCB隨時間的變化如圖4(d)所示,均在第2～3d VCB達到最大值,為0.11～0.92mg/(L·h),此時微生物濃度最大.

pH 值對TF-1 的生長及CB 的降解影響如圖5所示.設置pH 值范圍為4～10,pH 值在5～8 范圍內,TF-1 生長無顯著影響;pH 值為9 時,延遲期顯著增大,7d 后,耐受性提高后,菌體濃度微量增大;當酸堿性持續增強,pH 值為4 或8 時,11d 內,菌體無生長(圖5a).在各pH 值條件下, cCB均呈下降趨勢,pH 值為7 時,cCB下降最快,表明該條件下菌體酶活性最強;pH 值為5、6、8 和9 時,cCB變化趨勢基本一致;pH值為10 時CB 的殘余量最高,為34.81mg/L,降解率最低為38%;pH 值為4 時,降解率為47%,表明在酸性條件或是堿性環境中均對CB 有降解能力(圖5b).圖5(c)為CB 降解率隨pH 值的變化曲線,在pH 值為7時降解活性最強;進一步證實該菌屬可適應多種酸堿環境,在中性環境中活性最強.圖5(d)表示TF-1 每天的降解速率,從圖中可以看出,在第2d 和第6d 均出現峰值,可能是因為初始TF-1 需要利用CB 進行繁殖生長,隨著時間增長,TF-1 在脅迫條件下可能分泌的一些物質緩和了培養基中的酸堿度,在第6d 培養基中pH 值維持中性范圍,TF-1 的活性得以恢復,所以導致第2d 和第6d 對CB 降解率均達到最大.

本實驗選取的生物接種量為1%～10%,接種量對菌株TF-1 的生長及CB 降解的影響如圖6 所示.隨著接種量的增加,微生物的生長及CB 降解趨勢基本一致(圖6a、6b 所示),如圖6(b)所示,接種量為1%、2.5%、5%、7.5%、10%時,CB 最終降解率無顯著差異,降解菌生物量的升高短期內會促進CB的生物降解,但不影響最后的降解以及微生物的生長.圖6(c)為不同接種量下CB 總降解率及總降解速率,降解速率接種量為5%時降解率和VCB達到最大值,分別為72%和0.19mg/(L·h).不同接種量條件下,VCB隨時間的變化曲線如圖6(d)所示.第6d VCB值最大,可能是因為在第6d相關酶量積累到了最大值從而提升了 VCB.綜上所述,接種量為5%時是TF-1 的最適接種量.

圖5 pH 值對TF-1 生長及CB 降解的影響Fig.5 Effect of pH on TF-1growth and CB degradation

圖6 接種量對TF-1 生長及CB 降解的影響Fig.6 Effect of inoculum on TF-1 growth and CB degradation

對CB 降解微生物進行了廣泛調研,如表3 所示,與現有已知菌株相比,TF-1 的生長溫度范圍更廣耐酸堿能力更強.TF-1 的 CB 耐受濃度超過200mg/L,遠高于現有報道微生物的耐受濃度[21].污染場地環境復雜,作為持續性有機污染物,CB 降解困難,貧營養和富營養場地中均有污染,異養同化菌株在貧營養場地中適用性更強;研究表明,共代謝降解速率比同化速率更快,富營養場地中共代謝菌株適用性更強.當前功能菌株主要通過單一途徑對 CB 進行降解,限制菌體的廣泛使用,TF-1 不僅能夠異養同化氯苯,還可以琥珀酸鈉、檸檬酸鈉等為底物共代謝降解CB,TF-1 適用范圍更廣,可為貧營養和富營養污染場地CB 的修復提供重要的生物資源.

表3 CB 降解的細菌比較Table 3 Comparison of CB degrading bacteria

3 結論

3.1 粘質沙雷氏菌Serratia marcescens TF-1 可利用葡萄糖、乳糖、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、CB 等多種有機物為底物進行生長.CB 為底物時TF-1 的μmax為0.022gcell/(molCB·h),VCB為1.35mol/(gcell·h),對CB 耐受性高于200mg/L;隨cCB增大,VCB和μmax逐漸減小.

3.2 以琥珀酸鈉和檸檬酸鈉為底物,TF-1可共代謝降解CB.VCB最高分別為0.95 和1.11mol/(gcell?h),cCB＜80mg/L時,檸檬酸鈉更能促進微生物生長;當cCB＞80mg/L,VCB(檸檬酸鈉)(0.61～1.11mol/(gcell?h))＞VCB(琥珀酸鈉)(0.56～0.95mg/(L·h)),此時以檸檬酸鈉為底物更利于CB 降解.

3.3 TF-1 在20～35℃范圍內生長良好,30℃為最適生長溫度,平均VCB為0.472mg/(L·h);TF-1pH值為5～9 時生長良好,最適pH 值為7,平均VCB為0.237mg/(L·h);接種量為5%時,CB 降解能力最強.TF-1 具有相對較高的CB 耐受性和耐酸堿特性,可同時進行同化和共代謝降解CB.