強還原與生物炭對土壤酶活性和溫室氣體排放的影響

吉春陽,何云華,孫小飛,馬亞培,馬紅亮,高 人,尹云鋒* (1.福建師范大學,濕潤亞熱帶山地生態國家重點實驗室培育基地,福建 福州 50007；2.福建師范大學地理科學學院,福建 福州 50007；.福清市現代農業發展中心,福建 福清 5000)

近幾十年來,隨著農業現代化水平的提高,設施栽培已成為我國重要的農業生產模式之一[1].由于長期集約化經營和不合理管理等原因,土壤酸化、次生鹽漬化、養分失衡和土傳病害等連作障礙問題日益突出,已嚴重制約農業可持續發展[2].土壤強還原處理(RSD)亦被稱為生物或厭氧土壤滅菌,是一種作物種植前的土壤修復方法,通過向土壤中添加易分解有機物料,灌溉至水分飽和并覆膜,在短期內創造強還原環境,在溫度大于30℃條件下,處理2～3 周即可有效修復連作障礙[3-4].目前,在美國和日本的一些地區,已將其作為化學熏蒸的替代方法用于土壤滅菌[5],在我國也成功用于防控香蕉枯萎病、花卉和蔬菜等連作障礙[1,6].如朱同彬等[7]田間試驗發現RSD處理31d 后,設施黃瓜的發病率低于3.0%,增產率達392.0%～435.0%.值得關注的是,RSD 修復過程中亦會導致CO2與N2O 大量排放[3,8],Li 等[9]研究表明RSD 修復過程中綜合溫室效應(GWP)增加了64.1%～130.1%.

生物炭是生物質材料在缺氧或無氧條件下,高溫熱解產生的富含碳素、高度芳香化的一類物質[10],已被廣泛應用于農業領域.其不僅能提高土壤肥力、促進植物生長,亦可抑制多種土傳病原菌[11].如Jaiswal 等[12]發現添加生物炭能夠抑制腐霉菌(Pythium aphanidermatum )繁殖生長,降低黃瓜根腐病發生.同時,已有研究表明添加生物炭能夠減少溫室氣體排放[13].目前,關于RSD 與生物炭聯合修復對土壤溫室氣體排放的影響研究亦有報道,但結論尚不一致.如Wang 等[14]研究發現RSD 中添加3%的生物炭(玉米秸稈,400°C制備)后,土壤N2O排放量減少了40.7%,但Li 等[9]發現生物炭(小麥秸稈400℃制備,添加量為20t/hm2)應用于RSD 后,土壤N2O 排放量增加了35.2%.

土壤溫室氣體主要來自微生物過程,即土壤呼吸、硝化和反硝化等[15].酶在調控土壤有機質分解和養分循環過程中發揮著重要的作用[16],而生態酶化學計量比則反映微生物的新陳代謝與環境中養分有效性之間的生物地球化學平衡模式[17].因此,研究碳氮循環功能酶活性與土壤溫室氣體排放關系,將有助于深入揭示溫室氣體減排調控機制.王光飛等[18]研究辣椒疫病防控時發現,RSD 修復顯著提高了土壤多酚氧化酶和纖維素酶活性,生物炭(玉米秸稈500℃制備)修復抑制土壤β-葡萄糖苷酶和脲酶活性,且抑制作用隨添加量增加而增強[19].周際海等[20]研究表明生物炭(小麥秸稈350～550℃制備)與有機物料混施顯著提高了水稻土過氧化氫酶、脲酶和堿性磷酸酶活性,促進了土壤CO2和N2O排放.Wu等[15]研究表明與添加小麥秸稈相比,生物炭(小麥秸稈450℃制備)能夠減少N2O 排放,并發現CO2與N2O 排放量與β-葡萄糖苷酶和脲酶活性顯著相關.然而,從土壤酶活性變化角度探討RSD 和生物炭聯合修復對溫室氣體(CO2和N2O)排放的影響研究目前還鮮有報道.為此,本文通過培養實驗,研究RSD、生物炭以及二者聯合修復對設施蔬菜地土壤酶活性和溫室氣體排放的影響,分析環境因子、酶活性與溫室氣體排放的內在關聯,以期為退化土壤的修復和溫室氣體減排提供科學參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試土壤取自福建省福清市鏡洋鎮綠豐農業開發有限公司連續種植5a 的尖椒樣地,連作障礙嚴重.取0～15cm 土壤,剔除石塊和植物根系過2mm 篩,風干保存.選取水稻秸稈為有機物料,80℃烘干后粉碎,過2mm 篩密封備用.生物炭由水稻秸稈制備,將水稻秸稈粉碎過2mm 篩后用錫箔紙密閉包裹,置于管式爐(O-KTF1200,江蘇)450℃厭氧裂解2h,不同粒徑(0.25～2mm、0.053～0.25mm 和＜0.053mm)的比例分別為26.9%、56.3%和16.8%.供試土壤、水稻秸稈和生物炭基本性質如表1 所示.

表1 供試土壤、水稻秸稈和生物炭的基本性質Table 1 Basic properties of the soil, rice straw and biochar

1.2 實驗設計

實驗設4 個處理:未修復土壤(CK);RSD 修復(RSD),土壤+2%水稻秸稈;生物炭修復(BC),土壤+2%生物炭;RSD 與生物炭聯合修復(RSD+BC),土壤+2%水稻秸稈+2%生物炭.實驗開始前,先在風干土中添加去離子水調節土壤質量含水量至16%,于25℃恒溫培養箱中預培養7d.培養結束后,稱取相當于50.00g 干土重的新鮮土壤于自封袋中,按處理添加生物炭或水稻秸稈并與土壤充分混勻,用去離子水調節水分至田間最大持水量,隨后排空自封袋內空氣并封口.樣品隨機排列30℃恒溫培養15d.在0、1、3、5、7 和15d 進行破壞性取樣,隨機選取4 個重復采集氣體,4 個重復測定土壤基本性質.培養結束時取出部分土壤樣品自然風干,另一部分樣品置于4℃冰箱保存.

氣體采樣時,將自封袋口打開并置于通風櫥中通風15min,隨后將每個樣品放入1L 廣口瓶中,用橡膠塞封住瓶口并用封口膜密封.采樣前將廣口瓶輕微搖晃,確保瓶中氣體均勻.用注射器采集20mL 氣體保存于氣瓶中,隨后向廣口瓶補入20mL 氮氣,使內外氣壓一致.于培養箱中30℃培養1h 后再次采集20mL 瓶中氣體[12].根據廣口瓶1h 內的氣體累積量來計算土壤溫室氣體排放速率.

1.3 測定指標及方法

pH 值采用pH 計(Mettler FE28, 上海)測定,水土比(v/w)為2.5:1,水稻秸稈和生物炭的pH 值選擇水與秸稈或生物炭的比例(v/w)為15:1.土壤Eh 值采用Eh 計(Mettler FE28,上海)測定,水土比(v/w)為2.5:1.土壤NH4+-N 和NO3--N 含量用2mol/L 的KCl溶液浸提,260r/min 震蕩30min 后離心并過濾,所得溶液用連續流動分析儀(Skalar san++,荷蘭)測定.土壤TC、TN 含量用元素分析儀(Elementar Vario EL III,德國)測定.土壤可溶性有機碳(DOC)用去離子水浸提,水土比(v/w)為2:1,震蕩30min 后離心,使用0.45μm 濾膜過濾,用總有機碳分析儀(TOC-V CPH,日本)測定[10].

CO2采用配備FID檢測器的氣相色譜(GC-2010,日本)測定,N2O 采用配備ECD 檢測器的氣相色譜(GC-2014,日本)測定.CO2和N2O排放速率及累積排放量計算參見公式(1)和(2)[8].以CO2為參照,計算100a 時間尺度上GWP,計算參見公式(3)[9].

式中:F 為CO2和N2O 的排放速率, mg/(kg·h)和μg/(kg·h); ρ 為CO2和N2O 標準狀態下密度;ΔC/Δt 為廣口瓶內CO2和N2O 濃度增加量; T 為培養溫度,℃;V 為瓶中氣體有效空間體積, m3; m 為烘干土重量, kg. M 為CO2、N2O 累積排放量, mg/kg; t 為采樣時間, d; ti-ti-1為兩次采樣時間間隔;M(N2O)和M(CO2)分別為培養期間內土壤N2O 和CO2累積排放量, mg/kg.

土壤酶活性參照Saiya-Cork 等[21]測定方法.稱取1.00g 土壤,用125mL 醋酸緩沖液(50mmol/L, pH值為5.00)提取,用傘形酮(MUB)作為底物標示水解酶活性,用L-二羥苯丙氨酸(DOPA)為底物標示氧化酶活性.微孔板置于暗環境下20℃恒溫培養(水解酶4h 和氧化酶18h),培養結束水解酶加10μLNaOH 溶液(1mol/L)終止其反應,用多功能酶標儀(Spectra Max M5,美國)測定其熒光度(水解酶)或吸光度(氧化酶),通過土壤干重和反應時間來計算酶的活性.酶C:N 用ln(βG):ln(NAG)表征,酶C:P 用ln(βG):ln(AP)表征,酶N:P 用ln(NAG):ln(AP)表征[16]. 5 種土壤酶信息如表2 所示.

表2 土壤酶的縮寫、功能及底物Table 2 The abbreviations, function and substrates of soil enzymes

1.4 數據分析

利用SPSS 24.0 進行單因素方差分析比較處理間的差異顯著性(LSD 檢驗,P＜0.05).采用 Origin 2019b 軟件作圖.利用AMOS 24.0 進行結構方程模型(SEM)擬合,分析土壤基本性質、酶活性與溫室氣體之間的關系.為消除各變量量綱、數值大小對路徑分析結果權重的影響,在分析前對所有數據進行Z-score 標準化處理.

2 結果與分析

2.1 土壤基本性質變化

由圖1a 可知,培養期內BC 處理土壤pH 值波動下降,而RSD 與RSD+BC 處理的整體呈上升趨勢.培養結束時,RSD、BC 和RSD+BC 處理的pH值分別提高了1.2、0.7 和1.3 個單位. RSD、BC和RSD+ BC 處理的土壤Eh 值在1～7d 急劇下降,后期有所上升,培養結束時RSD 處理的Eh 值最低(圖1b).由表3 可見,與CK 相比,RSD、BC 和RSD+BC 處理的DOC 含量分別增加了149.9%、24.6%和 127.0%(P＜0.05).相較 CK, BC 處理的-N 含量顯著增加,而RSD 和RSD+BC 處理的顯著下降(P＜0.05),但二者NH4+-N 含量顯著高于CK 處理的(P＜0.05).培養結束時, RSD 處理土壤TC 含量和C:N 值顯著增加,而TN 含量變化并不顯著;BC 與RSD+BC 處理的TC、TN 含量和C:N值均顯著增加(P＜0.05).

圖1 不同處理土壤pH 值和Eh 的動態變化Fig.1 Dynamic changes of soil pH and Eh in different treatments

表3 培養結束時不同處理的土壤基本性質Table 3 Soil basic properties in different treatments after incubation

2.2 土壤酶活性和生態酶化學計量比

由表4 可知,與CK 相比,BC 處理對5 種酶活性影響并不顯著,而RSD 與RSD+BC 處理的則顯著提高(P＜0.05).其中,RSD處理的βG、CBH、PEO和NAG活性分別提高了6.0、7.4、2.7 和3.6 倍.RSD+BC 處理的酶活性較RSD 的顯著降低(βG 除外,P＜0.05).由圖2 可知,相較CK,RSD 與RSD+BC 處理對酶C:N值影響不顯著,但顯著提高了酶C:P 和酶N:P 值(P＜0.05),而BC 處理的酶C:N 和酶C:P 值顯著降低,但酶N:P 值顯著增加(P＜0.05).

表4 培養結束時不同處理的土壤酶活性Table 4 Soil enzyme activities in different treatments after incubation

圖2 不同處理的土壤生態酶化學計量比Fig.2 Soil eco-enzymatic stoichiometric ratios in different treatments

2.3 土壤CO2、N2O 排放速率、累計排放量和增溫潛勢的變化

培養期內,CK 處理土壤CO2的排放速率變化相對平緩,介于2.06～5.59mg/(kg·h)之間,BC 處理的整體呈下降趨勢,但在前3d 顯著高于CK 的(P＜0.05);RSD 與RSD+BC 處理的CO2排放速率顯著高于CK的(P＜0.05),且在第1d 達到峰值,分別為53.71 和78.67mg/(kg·h),之后呈波動下降趨勢,培養結束時仍高達22.10 和18.25mg/(kg·h)(圖3a).由圖3b 可知,培養期內,RSD 與CK 處理的土壤N2O 排放速率變化趨勢一致,均在第1d 時達到峰值,分別為582.52 和327.48μg/(kg·h),之后逐漸下降.而BC 與RSD+BC 處理的N2O 排放速率波動較小,分別在第3d 和第1d出現峰值49.79 和105.68μg/(kg·h),其他時間均低于35.00μg/(kg·h).培養結束時不同處理間N2O 排放速率無顯著差異.

圖3 不同處理的土壤CO2 和N2O 排放速率動態變化Fig.3 Dynamic changes of soil CO2 and N2O emission rates in different treatments

圖4 不同處理的土壤CO2、N2O 累積排放量和GWPFig.4 Cumulative CO2 and N2O emissions of soils and global warm potential in different treatments

從圖4 可見,與CK 相比,RSD 處理土壤CO2、N2O 累積排放量和GWP 分別提高了10.6、0.9 和2.2 倍,BC 處理CO2累積排放量增加了110.6%,但N2O 累積排放量和GWP 降低了80.8%和54.8%.相較于RSD 處理,RSD+BC 處理土壤CO2累積排放量無顯著變化,但N2O 累積排放量和GWP 顯著降低了86.9%和37.8%(P＜0.05).

2.4 土壤基本性質、酶活性與溫室氣體累積排放量間的關系

利用SEM 分析發現βG 與DOC 對CO2累積排放量具有直接正效應,效應值分別為 0.44 和0.56,βG 與CBH 通過影響DOC 含量間接影響CO2累積排放量.此外土壤pH 值對βG 與DOC 產生顯著的直接正效應(圖5a).土壤Eh 值對CBH 具有顯著的負效應(P＜0.01),并通過影響 NO3--N 和NH4+-N 含量間接影響N2O 的排放.土壤NO3--N和NH4+-N 含量與N2O 累積排放量呈顯著負相關關系(圖5b).

圖5 土壤基本性質和酶活性對CO2 和N2O 累積排放量影響的SEM 分析結果Fig.5 Structural equation model fitting results of the effects of soil basic properties and enzyme activities on cumulative emissions of CO2 and N2O

3 討論

3.1 RSD 與生物炭對土壤酶活性的影響

設施栽培過量施用化肥,土壤中無機養分含量過高,導致土壤酸化和鹽漬化[2],從而抑制酶的產生,故對照土壤中βG、CBH、NAG 活性均處于較低水平.RSD 修復后5 種酶活性均顯著提高,王光飛等[18]同樣發現RSD(以水稻秸稈為有機物料)28°C條件下修復20d 后,土壤的多酚氧化酶和纖維素酶活性顯著提高.添加有機物料使土壤SOM含量提高,不僅為酶促反應提供了充足底物,亦可作為酶促反應的有機載體[22].此外, SEM 分析發現βG 和CBH 活性與pH 值正相關,與Eh 值負相關,這與Bonnett 等[23]研究結果相吻合.其原因是RSD 改善了土壤理化性質,增強了微生物活性,進而有利于酶活性提高.土壤酶計量受養分可用性及微生物生存代謝需求的影響,酶C:N、C:P、N:P 分別反映了微生物獲取C、N、P的相對需求[17].CK 的酶C:N 較高而酶C:P 和酶N:P較低,表明相對于N 元素,微生物受C 和P 元素限制.RSD處理顯著提高酶C:P和酶N:P,這可能是有機物料添加使C 和N 元素可用性增加所致.

研究表明,添加生物炭對土壤酶活性的影響存在很大的不確定性,這與生物炭的類型、施用量、底物、酶種類與生物炭的相互作用以及土壤特性等有關[24].本研究發現短期內添加生物炭對βG、CBH、NAG、PEO 和AP 活性無顯著影響,這與張玉蘭等[25]研究結果相近,而RSD+BC 處理的酶活性較RSD 的顯著降低,這可能與生物炭對反應底物或酶的吸附有關.生物炭表面具有高電勢,在酶與底物充足條件下,能吸附部分有機分子(酶和底物),阻止酶促反應的進行,從而改變酶活性[26].同時,生物炭的孔隙亦會對酶、營養物質及微生物產生共定位和吸附效應,降低酶的產生與活性[25].BC 處理的酶C:N 顯著降低,這是因為添加生物炭提高了土壤TC 和C:N.

3.2 RSD 與生物炭對土壤CO2 排放的影響

本研究中,RSD 處理土壤CO2排放量增加了10.6 倍,這與Li 等[9]田間實驗結果相近,他們發現RSD 處理CO2排放量較未修復土壤增加了1.3倍.RSD 處理施入大量秸稈,促進了微生物的生長和代謝,從而排放大量CO2.SEM 擬合結果亦表明DOC對CO2累計排放量產生直接顯著正效應;同時,βG 和CBH 亦能通過正向增加DOC 含量間接影響土壤CO2排放.Chen 等[27]研究發現,添加蔗糖和玉米秸稈能刺激土壤βG、CBH 活性,且與CO2總排放量和SOM 分解產生的CO2顯著相關,這與本研究結果基本一致.在秸稈分解初期,由易分解部分產生的底物刺激R-策略微生物迅速繁殖[28],會分泌更多的酶來加速SOM 分解.

單獨生物炭處理亦顯著增加了土壤CO2排放量,但其增加量顯著低于 RSD 和 RSD+BC 處理的.Brassard 等[29]研究6 種生物炭對兩類不同農業土壤CO2排放的影響,發現在培養前10d生物炭顯著增加了CO2排放量.這主要是由生物炭中部分活性碳及無機碳酸鹽所致[30].RSD+BC 處理的CO2累計排放量較RSD 處理的有所增加,但差異并不顯著.Luo等[31]認為同時添加有機物料與生物炭,有機物料會刺激微生物活性,引起生物炭與有機物料的共代謝分解,增加CO2排放量,但這種共代謝分解通常是一種短期效應.總體而言,生物炭添加所增加的CO2排放量僅占其自身所含碳量的很小一部分,并不會損害其在土壤中的固碳潛力[30].

3.3 RSD 與生物炭對土壤N2O 排放的影響

本研究表明,RSD 處理顯著增加了土壤N2O 累積排放量,這與王軍等[32]的研究結果相近,他們發現RSD 修復N2O 累積排放量是非修復土壤的950 倍.土壤N2O 主要來源于硝化作用和反硝化作用[33].設施蔬菜生產過程中過量施用化學氮肥,導致土壤中積累了大量NO3--N,而RSD 處理創造的厭氧環境促進了反硝化反應,故在培養1～5d N2O 排放速率顯著增加,隨后NO3--N 被大量消耗,導致N2O 排放速率逐漸降低.另外,在RSD 初期土壤中仍有O2存在,能夠滿足硝化微生物的需求,硝化作用亦會同時發生,這也解釋了培養結束時土壤NH4+-N 含量較初始值顯著降低.郎漫等[34]研究淺層淹水條件下不同施肥處理對黑土溫室氣體排放的影響時亦發現硝化和反硝化同時進行.雷宏軍等[35]的研究發現土壤 Eh值和-N 含量是影響N2O 排放的重要因素.本研究中,SEM 分析表明土壤Eh 通過影響NO3--N 和NH4+-N 含量間接影響N2O 排放量,且NO3--N 和NH4+-N 含量與N2O 累積排放量呈負相關關系.

研究發現,在土壤孔隙充水率(WFPS)大于70%條件下,添加生物炭可以減少土壤N2O 排放[36],如Harter 等[37]發現在土壤WFPS 為95%的環境中,添加2%和10%生物炭(綠色廢物,700°C 制備)土壤N2O 排放速率均顯著降低.本研究亦發現,單獨添加2%生物炭處理的N2O 累積排放量較對照處理的降低了80.8%.同時,與RSD 處理相比,RSD+BC 處理的N2O 累積排放量減少了86.9%,這與Wang 等[14]的研究結果相吻合.研究表明,生物炭通過提高土壤pH 值以增強N2O 還原酶的活性,催化N2O 還原為N2,從而減少N2O 排放[38].但在本研究中生物炭減少N2O 排放顯然與土壤pH 值無關,因為RSD 對pH的提升幅度顯著大于BC 處理.對比培養結束時不同處理的土壤NO3--N 含量,本研究中添加生物炭導致N2O 排放減少主要與NO3--N 還原受到抑制有關.施加生物炭導致土壤微域環境中含氧量較高,能夠抑制反硝化作用;同時亦有研究表明生物炭能夠吸附土壤 NO3--N,進而影響 N2O 排放[39].此外,Harter 等[40]在水分飽和的土壤添加10%的生物炭(綠色廢物,700°C 制備)28°C 培養15d 后發現,攜帶典型和非典型NosZ 功能基因的微生物群落豐度和多樣性顯著增加,加速了N2O 向N2的轉化,其培養環境與本研究相近,因此微生物群落組成改變亦可能是生物炭和RSD 與生物炭聯合修復N2O 排放減少的原因之一.

4 結論

4.1 RSD 和RSD+BC 修復顯著提高設施菜地土壤酶活性(βG、CBH、PEO、NAG、AP)、酶C:P 和酶N:P 值,而生物炭單獨修復對酶活性的影響不大.

4.2 RSD 單獨修復顯著提高了土壤CO2和N2O 排放量,生物炭單獨修復亦顯著提高了CO2排放量,但N2O 排放量顯著降低.RSD 處理中施用生物炭可有效減少N2O 排放和GWP.

4.3 土壤pH 值與Eh 通過影響βG 和CBH 活性以及DOC 含量間接影響了CO2排放,而Eh 通過影響NO3--N 和NH4+-N 含量間接影響了N2O 排放.