解整合素-金屬蛋白酶33基因多態性與兒童支氣管哮喘易感性及血漿炎癥因子水平的關系▲

馬蘭紅 白 玲 李奇鳳

(新疆兒童醫院1 兒科，2 科教科，烏魯木齊市 830000，電子郵箱；xingbabke@163.com)

支氣管哮喘是多種炎癥細胞(如肥大細胞、T淋巴細胞等)，以及多種炎癥因子參與的慢性變態反應性疾病，其特征是發生氣道高反應性[1]。兒童支氣管哮喘的特點是起病急、癥狀重，病情不易控制，如病情長期遷延可導致哮喘反復發作，不利于兒童生長發育[2]。因此，深入研究支氣管哮喘的發生與發展的機制，有助于尋找評估哮喘嚴重程度的指標及有效的治療藥物。支氣管哮喘的病理生理表現為支氣管局部大量炎癥細胞浸潤，且伴有大量炎癥因子的釋放，如Th1型細胞可產生γ-干擾素，而Th2型細胞能夠分泌白細胞介素(interleukin,IL)-4及IgE，IgE誘導肥大細胞及嗜酸性粒細胞脫顆粒，進而釋放組胺等介質，導致氣道高反應性[3]。此外，炎癥因子還可刺激氣道平滑肌細胞增生肥大及氣道纖維化等，引起氣道重塑及氣道狹窄的發生。解整合素-金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM)33基因位于20p13，該基因編碼13個外顯子，編碼的蛋白屬于ADAM家族成員，具有ADAM家族共有的一個解體蛋白和金屬蛋白酶結構域。ADAM33是膜錨定蛋白，參與了細胞-細胞和細胞-基質相互作用的各種生物過程，如受精、肌肉發育和神經發生等生理過程，以及腫瘤、炎癥等疾病的發生和發展[4-5]。近年來有研究顯示，ADAM33基因的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)與支氣管哮喘的易感性有關，其參與了支氣管哮喘中氣道高反應性的發生[6]。本研究通過檢測支氣管哮喘患兒血漿ADAM33 rs678881及rs2853209基因SNP，以及血漿γ-干擾素、IL-4、IgE的表達水平，分析ADAM33 rs678881及rs2853209與兒童支氣管哮喘的易感性及其與γ-干擾素、IL-4、IgE的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月至2019年2月期間于我院兒科門診診治的238例支氣管哮喘患兒作為哮喘組，其中男性115例、女性123例，年齡2～14(6.2±2.4)歲。納入標準：(1)均為初次診治，支氣管哮喘診斷均符合《兒童哮喘診斷標準》[7]；(2)患兒1月內無呼吸道感染、泌尿系統感染等感染性疾病發生；(3)無嚴重心臟及其他肺部等疾病。排除標準：(1)近期應用糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物的患兒；(2)合并過敏性紫癜等其他免疫性疾病的患兒；(3)患兒家屬拒絕參加本研究。以同期進行健康體檢的160例兒童作為對照組，其近1個月均無感染性疾病病史、無合并免疫性疾病或糖皮質激素用藥史、無嚴重心肺疾病。其中男性88例、女性72例，年齡1～14(6.3±2.5)歲。哮喘組和對照組兒童的性別、年齡差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究經本院倫理委員會審核批準通過。

1.2 觀察指標的檢測

1.2.1 標本的獲取及處理：取兩組兒童晨起空腹靜脈血約4 mL，乙二胺四乙酸抗凝，其中2 mL全血用于提取外周血DNA，另外2 mL標本在4℃條件下2 000 r/min離心10 min分離血漿，用于檢測血漿中γ-干擾素、IL-4、IgE水平。

1.2.2 ADAM33基因rs678881及rs2853209的SNP檢測：采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法進行檢測。應用基因組DNA提取試劑盒(日本Takara公司，批號：KA5801CA)提取外周血DNA，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。應用NaroDrop2000超微量分光光度計(美國賽默飛公司)檢測DNA的濃度及純度，核酸電泳鑒定其完整性，置于-20℃冰箱保存。ADAM33 rs678881上游引物5′-TTCAAAGCCTCCCCCTCTCATC-3′，下游引物5′-TGATCCAGGAAAAGCCACAGC-3′；ADAM33 rs2853209上游引物5′-AGGGTGAGGCAGCCAGCT-3′，下游引物5′-CTTCCTCAGTGGCCTCCCAGTCAATCG-3′。引物由上海生工生物技術有限公司合成。PCR總反應體系25 μL，包括模板DNA 0.2 mg，上下游引物各0.1 μmoL，12.5 mL PCR Master，雙蒸水補足體系。PCR程序為在95℃下預變性3 min，94℃下變性30 s，60℃下退火45 s，72℃下延伸30 s，72℃延伸7 min，共45個循環。限制性內切酶的酶切反應總體體系10 μL，包括PCR產物8 μL，核酸限制性內切酶(EcoRⅠ)2 U，雙蒸水補足體系。酶切反應條件為37℃水浴4 h。產物進行凝膠電泳，鑒定基因型。

1.2.3 血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的檢測：應用酶聯免疫吸附法檢測血漿中γ-干擾素、IL-4、IgE水平，試劑盒購自英國Abcam公司(貨號：ab46025、ab215089、ab108650)，操作嚴格按照說明書進行 。

1.3 記錄哮喘組的并發癥發生情況 觀察支氣管哮喘患兒的消化道反應(包括腹痛腹瀉、消化道出血、糞便隱血實驗陽性)、縱隔或皮下氣腫、呼吸衰竭、心律失常、腎炎等并發癥的發生情況。

1.4 統計學分析 應用SPSS16.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或方差分析；計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Logistic回歸模型計算比值比(odds ratio,OR)以分析ADAM33基因rs678881、rs2853209位點各基因型、等位基因與兒童支氣管哮喘易感性的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ADAM33 rs678881、rs2853209基因型和等位基因的分布及其與支氣管哮喘易感性關系 (1)ADAM33 rs678881： 哮喘組與對照組的ADAM33 rs678881 GC、CC及GG基因型比例差異有統計學意義(χ2=26.189，P<0.001)；與攜帶ADAM33 rs678881 GG基因型相比，攜帶GC、CC基因型的兒童更易發生支氣管哮喘(均P<0.05)。哮喘組ADAM33 rs678881 C等位基因分布頻率高于對照組(χ2=30.329，P<0.001)；與攜帶ADAM33 rs678881G等位基因相比，攜帶C等位基因型的兒童更易發生支氣管哮喘(P<0.05)。(2)ADAM33 rs2853209 ：兩組ADAM33 rs2853209各基因型比例以及等位基因分布頻率比較，差異均無統計學意義(χ2=0.108，P=0.948；χ2=0.153，P=0.696)。見表1。

表1 ADAM33基因rs678881、rs2853209位點各基因型、等位基因分布及其與支氣管哮喘易感性的關系[n(%)]

2.2 兩組研究對象血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較 與對照組相比，哮喘組患兒血漿IL-4、IgE水平較高，而γ-干擾素水平較低(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組研究對象血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較(x±s)

2.3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型哮喘組患兒的血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較 ADAM33 rs678881各基因型患兒之間血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平差異均有統計學意義(F=34.011，P<0.001;F=9.637,P=0.001;F=103.882，P<0.001)，其中攜帶ADAM33 rs678881 GG、GC、CC基因型患兒血漿IL-4、IgE水平依次升高，而γ-干擾素依次降低(均P<0.05)。rs2853209各基因型患兒之間血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平差異均無統計學意義(F=0.535，P=0.591;F=0.393,P=0.677；F=2.064,P=0.130)。見表3。

表3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型支氣管哮喘患兒的血漿γ-干擾素、IL-4、IgE水平的比較(x±s)

2.3 ADAM33 rs678881、rs2853209各基因型與支氣管哮喘并發癥發生情況的比較 與攜帶ADAM33 rs678881 GG基因型相比，攜帶GC、CC基因型支氣管哮喘患兒的并發消化道反應發生率較高(均P<0.05)，而縱隔或皮下氣腫、呼吸衰竭、心律失常、腎炎的發生率差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表4。rs2853209各基因型支氣管哮喘患兒的消化道反應、縱隔或皮下氣腫、呼吸衰竭、心律失常、腎炎發生率差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表5。

表4 ADAM33 rs678881各基因型支氣管哮喘患兒的并發癥發生情況的比較[n(%)]

表5 ADAM33 rs2853209各基因型支氣管哮喘患兒的并發癥發生情況的比較[n(%)]

3 討 論

支氣管哮喘是兒童常見的呼吸系統慢性疾病。近年來我國兒童支氣管哮喘的患病率有逐漸增高的趨勢，其不僅影響患兒健康，還給家庭及社會帶來沉重負擔[8]。多數支氣管哮喘患者經規范、足療程的支氣管擴張劑和吸入激素治療后病情可達到完全控制，但仍有部分患者的病情不能完全控制，特別是支氣管哮喘患兒，治療難度大，病情遷延易導致哮喘反復發作。因此，深入研究支氣管哮喘的發病機制，尋找關鍵的診斷治療靶點具有重要意義。支氣管哮喘是一種與多基因遺傳有關的疾病，受到遺傳和環境等因素的影響，目前已發現多種支氣管哮喘的易感基因，影響疾病的發生和發展[9]。ADAM33基因是近年來發現的新的支氣管哮喘易感基因，其為ADAM家族成員，編碼蛋白含800個氨基酸，包含許多保守的結構域等，如信號肽、金屬蛋白酶、解整合素、跨膜結構域及細胞內糖蛋白結構域，通過相應結構域參與各種信號轉導途徑。研究表明，ADAM33蛋白在平滑肌細胞及間質細胞中表達豐富，而上皮細胞中表達量較低，ADAM33蛋白水解酶活性的提高與支氣管哮喘發生時氣道高反應性及肺功能下降關系密切，參與氣道重塑等病理過程[10]。而ADAM33基因的SNP能影響支氣管哮喘的遺傳易感性[11]。因此，深入研究影響支氣管哮喘發生和發展的ADAM33基因關鍵SNP位點，為防治支氣管哮喘提供理論依據具有重要意義[12]。

本研究分析ADAM33 基因rs678881位點的SNP與支氣管哮喘易感性的關系，結果顯示，與對照組比較，哮喘組ADAM33 rs678881 GC、CC基因型比例以及C等位基因頻率均更高(均P<0.05)；與攜帶ADAM33 rs678881 GG基因型、G等位基因相比，攜帶GC、CC基因型及C等位基因的兒童更易發生支氣管哮喘(P<0.05)。這表明ADAM33 rs678881 GC、CC基因型與支氣管哮喘的遺傳易感性有關，C等位基因型增加兒童支氣管哮喘的易感性[12]。分析原因可能是由于ADAM33 rs678881的基因位點位于基因啟動子區CpG島的位置，正常上皮細胞中CpG島處于高甲基化狀態，而間質細胞如平滑肌細胞中甲基化程度較低，支氣管哮喘發生時該位點的SNP導致ADAM33基因甲基化程度減弱，促進該基因的表達，ADAM33進而參與促進氣道高反應性及氣道重塑性改變[5，13]。而本研究結果提示ADAM33 基因rs2853209位點的SNP未增加支氣管哮喘患兒的遺傳易感性，其機制尚不清楚，可能是該位點位于內含子區域，對ADAM33蛋白表達量及活性的影響不明顯。

此外，本研究中攜帶ADAM33 rs678881 GC、CC基因型的支氣管哮喘患兒血漿IL-4、IgE水平均明顯高于攜帶GG基因型的患兒，而γ-干擾素水平均低于GG基因型患兒(均P<0.05)，表明ADAM33 基因rs678881的SNP可能與反映支氣管哮喘嚴重程度的血漿指標γ-干擾素、IL-4、IgE水平有關，ADAM33基因rs678881的SNP也參與促進支氣管哮喘的發展。其原因可能為：一方面，ADAM33 基因的表達受到氣道炎癥程度的調控。研究顯示，支氣管哮喘發生時，Th2類細胞因子如IL-4、轉化生長因子β能夠直接促進ADAM33 基因的表達，促進成纖維細胞的分化及增殖，導致氣道重塑[14]，而抑制ADAM33 基因表達的γ-干擾素顯著下調，進一步促進成纖維細胞的增殖[15]。另一方面，ADAM33本身具有金屬蛋白酶活性，能夠促進膜結合的生長因子及其相應受體的釋放，如表皮生長因子及其受體、胰島素生長因子及其受體等，促進T細胞向Th1和Th2亞型分化，促進Th2亞型IL-4的表達，招募并活化B細胞產生IgE[16-17]。因此，ADAM33與γ-干擾素、IL-4等炎癥介質間可能存在正反饋環路，共同促進支氣管哮喘的發展。

本研究進一步分析ADAM33基因rs678881及rs2853209位點各基因型與支氣管哮喘患兒并發癥的關系，結果顯示攜帶ADAM33基因rs678881 GC、CC基因型支氣管哮喘患兒的消化道反應的發生率高于GG基因型(P<0.05)，而不同rs2853209基因型患兒間的并發癥的發生率差異并無統計學意義，表明ADAM33 rs678881 GC、CC基因型可能有助于判斷支氣管哮喘患兒有無消化道反應的發生，其原因可能是rs678881 GC、CC基因型患兒的機體處于炎癥反應狀態較重，引起胃腸道功能紊亂，導致嘔吐、腹瀉等臨床癥狀[18]。

綜上所述，ADAM33 rs678881 GC、CC基因型及C等位基因增加支氣管哮喘患兒的易感性，而rs2853209基因SNP可能與支氣管哮喘患兒的易感性無關。同時，攜帶ADAM33 rs678881 GC、CC基因型的支氣管哮喘患兒血漿IL-4、IgE水平較高而γ-干擾素水平較低，且消化道反應的發生率高，ADAM33 rs678881 GC、CC基因型可能參與了兒童支氣管哮喘的發展。但本研究樣本量較小，未能考慮環境因素對支氣管哮喘的影響，因此有待進一步研究以驗證ADAM33基因SNP對兒童支氣管哮喘發生與發展機制的影響。