基于AB-8 大孔吸附樹脂制備余甘子果實精制物及其在卷煙中的應用

葉 燁，李東亮，耿宗澤，杜樹山，徐 恒*

1. 四川中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，成都市錦江區(qū)成龍大道1 段56 號 610066

2. 北京師范大學中藥資源保護與利用北京市重點實驗室，北京市海淀區(qū)新街口外大街19 號 100875

卷煙添加天然植物香原料，是發(fā)展“中式卷煙”的措施之一，通過賦予卷煙不同的香氣與吸味，可以實現(xiàn)卷煙產(chǎn)品風格多樣化，并改善卷煙感官舒適性［1-3］。然而天然香原料成分復雜，在添加天然香原料有效成分的同時也會引入一些影響卷煙抽吸評價的物質(zhì)，對天然香原料粗提物進行精細加工，可以有效解決該問題［4-6］。

余甘子（Phyllanthus emblicaLinn.），別稱庵婆羅、滇橄欖、油甘子等，為大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠屬（Phyllanthus）植物［7］，因其果實初食酸澀，良久乃甘，故名“余甘子”。我國將其列入既是食品又是藥品的兩用植物名單［8-9］。余甘子果實可新鮮食用或加工成食品，在我國四川、廣東和云南等地飲用余甘子茶，可有效緩解消化不良［10-11］。余甘子果實不僅富含17 種人體所需氨基酸及維生素、多酚、類黃酮和糖類成分，也含有沒食子酸、黏液酸、蘋果酸和綠原酸等多種有機酸成分［12-16］。有機酸在卷煙上的作用主要是增加煙氣的酸性、提高煙氣濃度，使煙氣醇和，增加甜潤感和提高舒適性，在煙用香料的功能成分中占有重要位置［17］。但是余甘子果實提取物因含有果膠、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)等成分，直接添加應用在卷煙上，會產(chǎn)生燒灼氣息和一定程度的口腔澀感，導致卷煙感官評價不佳。因此，本項目中主要研究利用AB-8 型大孔吸附樹脂對余甘子果實提取物進行精制加工，并評價精制物在卷煙中的應用效果，旨在開發(fā)天然植物香原料余甘子果實的精制工藝，為余甘子果實精制物的應用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

市售2018 年云南產(chǎn)余甘子干燥果實；空白卷煙（四川中煙工業(yè)有限責任公司）。

沒食子酸（99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇（AR，成都科龍化工有限公司）；乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；AB-8 大孔樹脂（AR，上海麥克林生化科技有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

Acquity UPLC H-Class 超高效液相色譜儀，配PDA 檢測器（美國Waters 公司）；1290 Infinity 超高效液相色譜儀，配DAD 檢測器（美國Agilent Technologies 公司）；R-210 型旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Büchi 公 司）；Milli-Q Direct 8 純 水 儀（美 國Millipore 公司）；SCIENTZ-10N 冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Avanti JXN-26 離心機（美國Beckman Coulter 公司）；MS 204S 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；0.22 μm 微孔過濾器（天津津騰實驗設備有限公司）；LDP-400A 型粉碎機（浙江永康市紅太陽機電有限公司）；孔徑0.15 mm（100 目）標準分樣篩（浙江上虞市華豐五金儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大孔吸附樹脂的活化處理

取AB-8 型大孔樹脂，用95%（體積分數(shù)）乙醇浸泡過夜，過濾，用蒸餾水洗滌樹脂至無乙醇氣味。將醇洗后的大孔樹脂先用4 倍柱體積的5%（質(zhì)量分數(shù)）鹽酸溶液浸泡4 h，然后用蒸餾水洗至流出液pH 為中性；再用3% NaOH 溶液浸泡4 h，最后用蒸餾水洗至流出液pH 為中性。

1.2.2 余甘子果實粗提物的制備

稱取3 份余甘子干燥果實各10.0 g，經(jīng)粉碎機粉碎后，過分樣篩，按照1∶10 的料液比（質(zhì)量比），分別加入純水、50%和90%乙醇溶液，加熱回流提取3 次，每次1 h。分別合并3 次的提取液，浴溫50 ℃、體系壓力0.08 MPa 條件下減壓濃縮至無乙醇氣味，分別冷凍干燥后得粗提物。

1.2.3 利用AB-8 型大孔吸附樹脂精制余甘子果實提取物

稱取50.0 g 干燥余甘子果實，按1.2.2 節(jié)的方法得到20.37 g 余甘子果實粗提物，加入4 倍量（質(zhì)量比）95%乙醇，靜置醇沉24 h，以10 000 轉/min 離心10 min；取上清液濃縮至無乙醇氣味，得到除去多糖的余甘子果實粗提物9.45 g，標記為A。

稱取500 g 1.2.1 節(jié)中活化后的AB-8 型大孔吸附樹脂（原料∶填料=1∶10，質(zhì)量比）裝入色譜柱（5cm×70 cm），然后將除去多糖的余甘子果實粗提物用少量蒸餾水溶解，再上樣至色譜柱，控制樣品溶液流速約為5 mL/min，過夜吸附。吸附結束后，依次用純水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇和95%乙醇溶液以10 mL/min 的流速洗脫，收集各個部分洗脫液后，在浴溫50 ℃、體系壓力0.08 MPa 下減壓濃縮至干，所得各流份（精制物）分別標記為A1、A2、A3、A4 和A5。

1.2.4 標準品的配制

精密稱取200 mg 沒食子酸（精確至0.1 mg），置于100 mL 棕色容量瓶中，用20%乙醇溶解并定容，配制2 mg/mL 標準溶液；精密移取0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL 分別置于10 mL 容量瓶中并定容，得系列沒食子酸對照品溶液。

1.2.5 供試樣品溶液的配制

稱取經(jīng)冷凍干燥的余甘子果實純水粗提物、除去多糖的余甘子果實粗提物和余甘子果實精制物（A1）各250 mg（精確至0.1 mg），用20%乙醇溶解并定容至25 mL，配制10 mg/mL 供試樣品溶液，經(jīng)微孔過濾器過濾后，裝入2 mL 液相色譜瓶。

1.2.6 余甘子果實提取物的HPLC 分析

參考文獻［15，18］中的方法進行HPLC 分析。將純水、50%乙醇和90%乙醇余甘子果實提取液使用Acquity UPLC H-Class 超高液相色譜儀進行分析（方法1）：ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：乙腈和水（含0.1%甲酸），流速0.2 mL/min；洗脫條件：0～5 min 5%乙腈，5～15 min 5%～30%乙腈，15～20 min 30%～95%乙腈；檢測波長：273 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。

余甘子果實粗提物及沒食子酸的定量分析使用1290 Infinity 超高液相色譜儀進行（方法2）：ACQUITY UPLC HSS PFP 色 譜 柱（1.8 μ m，2.1mm×100 mm）；流動相：乙腈和水（含0.1%甲酸），流速0.2 ml/min；洗脫條件：0～2.5 min 無乙腈，2.5～3.0 min 0～6%乙腈，3.0～7.0 min 6%乙腈，7.0～9.0 min 6%～20%乙腈，9.0～13.0 min 20%～40%乙腈，13.0～14.0 min 60%～95%乙腈，14.0～16.0 min 95%乙腈；檢測波長：273 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。

1.2.7 卷煙感官作用評價

用10%乙醇溶液配制質(zhì)量分數(shù)為2%的待評價樣品溶液，分別向每支空白卷煙中注射2.0 μL待評價樣品溶液，對照組為注射等量的10%乙醇。將加香后的樣品煙支和對照組煙支分別置于溫度（22±2）℃和相對濕度（60±3）%的環(huán)境下平衡48 h。由7 名通過中國煙草總公司專業(yè)資質(zhì)認證的卷煙感官評吸專家參照YC/T 496—2014［19］的方法進行感官評價。

2 結果與討論

2.1 不同余甘子果實提取物比較

提取溶劑對天然產(chǎn)物提取物中化學成分的種類和質(zhì)量分數(shù)有決定性影響，提取物在卷煙中應用的感官評價效果也不同。本研究中先考察了不同溶劑對余甘子果實提取物得率和卷煙應用效果的影響。對不同溶劑提取的余甘子果實提取物進行HPLC 分析的結果如圖1 所示，可知：圖1a 中余甘子果實的純水提取物中的化學成分種類較少，主要成分明顯，液相色譜保留時間集中在1～4 min內(nèi)；圖1b 中50%乙醇提取物中的化學成分種類增多，液相色譜保留時間在1～2 min 內(nèi)的成分的質(zhì)量分數(shù)高于保留時間在2～5 min 內(nèi)的成分；90%乙醇提取物中的化學成分種類最多，液相色譜保留時間在1～5 min 內(nèi)成分的響應值明顯低于前兩種提取物，而保留時間在17～19 min 內(nèi)的成分顯著高于前兩種提取物。分析HPLC 譜圖可知，3 種不同溶劑余甘子果實提取物中化學成分差異明顯。3 種提取物的卷煙應用感官評價結果表明：純水和50%乙醇提取物對卷煙煙氣表現(xiàn)出不同程度的改善作用，煙氣更柔和、細膩，潤甜感增加，刺激性降低，純水提取物表現(xiàn)更佳；90%乙醇提取物未表現(xiàn)出對感官舒適性的改善作用，且表現(xiàn)出與卷煙煙氣不諧調(diào)。3 種余甘子果實提取物的提取得率：純水＞50%乙醇＞90%乙醇（表1）。綜上所述，優(yōu)選純水為提取溶劑制備余甘子香原料。

表1 不同溶劑余甘子果實提取物的提取得率Tab.1 Extraction rates of Phyllanthus emblica fruits by different extraction solvents

2.2 用大孔吸附樹脂對余甘子果實提取物的精制

由于余甘子果實粗提物中含有大量的多糖、果膠、淀粉等大分子成分，將提取液濃縮時易析出難溶物；在用大孔吸附樹脂精制粗提物時，純水洗脫易出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，且層析柱中出現(xiàn)大量絮狀物，影響精制效果。因此采用水提醇沉的方法使多糖等大分子物質(zhì)沉淀析出，得到除去多糖的余甘子果實粗提物。余甘子果實多糖成分的精制加工及在卷煙上的應用，本研究中暫不關注。

各梯度洗脫液經(jīng)濃縮至干后的質(zhì)量見表2，結果表明：純水、不同濃度的乙醇洗脫流份的得率為純水＞10%乙醇＞30%乙醇＞95%乙醇＞50%乙醇，色澤由淡黃色向深褐色轉變。不同濃度乙醇洗脫流份的HPLC 指紋圖譜見圖2，可知：純水洗脫流份的化學成分種類較少，其保留時間主要集中在2～3 min 與5～6 min 區(qū)間，且洗脫流份干物質(zhì)得率高達65.9%，主要酚酸成分為沒食子酸［15］。10%乙醇洗脫流份的保留時間主要集中在6～8 min 區(qū)間，沒食子酸仍為主要成分，同時含有較多的未知成分。30%、50%和95%乙醇洗脫流份的成分主要集中在保留時間10～14 min 區(qū)間，是一些極性相對小的鞣質(zhì)成分［18，20］。以上結果表明，AB-8 型大孔吸附樹脂可以很好地富集余甘子果實提取物中的沒食子酸等簡單酚酸類成分。根據(jù)各流份的卷煙感官評吸結果（表3）可知，添加純水洗脫流份的卷煙樣品對煙氣修飾作用明顯，可增加潤甜感，改善抽吸時的舒適感；而添加10%、30%和50%乙醇洗脫流份的卷煙樣品則表現(xiàn)出不同程度的負面作用，例如對口腔的刺激性，對煙氣無改善效果；添加95%乙醇洗脫流份的卷煙樣品刺激性降低，但有雜氣產(chǎn)生，與煙氣不諧調(diào)。綜上所述，對卷煙感官起正面作用的有效成分主要存在于純水洗脫流份中，因此將純水洗脫流份優(yōu)選為余甘子果實精制物。

表2 粗提物經(jīng)大孔吸附樹脂精制得到的各流份的質(zhì)量Tab.2 Quality of each fraction separated by macroporous resin from the crude extract

2.3 提取物中沒食子酸的定量分析結果

將7 個濃度梯度的標準溶液進行HPLC 分析，以沒食子酸的濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y）進行回歸分析，得到?jīng)]食子酸的回歸方程為y=10 006x+762.89（R2=0.999 1），表明沒食子酸在0.05～1.60 mg/mL 范圍內(nèi)線性關系良好。

表3 粗提物經(jīng)大孔吸附樹脂精制后各流份的卷煙感官評價結果Tab.3 Result of sensory evaluation of each fraction separated by macroporous resin from the crude extract

將按1.2.5 節(jié)中方法配制的供試樣品溶液進行HPLC 定量分析，3 種余甘子果實提取物中沒食子酸的質(zhì)量分數(shù)如表4 所示。結果表明：相比余甘子果實粗提物和除去多糖的余甘子果實粗提物，沒食子酸在余甘子果實精制物中的質(zhì)量分數(shù)分別提高了144.79%和38.05%。

2.4 精制前后余甘子果實提取物在卷煙中應用的感官評價比較

余甘子果實粗提物、除去多糖余甘子果實粗提物和余甘子果實精制物的卷煙感官評吸結果（表5）顯示，與余甘子果實粗提物和除去多糖余甘子果實粗提物相比，余甘子果實精制物在修飾卷煙煙氣和提高卷煙舒適性方面效果最佳：一是降低了粗提物產(chǎn)生的麻刺和粗糙感；二是可突出潤甜感，改善舒適性；三是使煙氣更加柔和、細膩。

表4 3 種余甘子果實提取物中沒食子酸的質(zhì)量分數(shù)及增量百分比Tab.4 Gallic acid contents and increasing percentages of three Phyllanthus emblica extracts

表5 3 種余甘子果實提取物的卷煙應用感官評價結果Tab.5 Sensory evaluation results from test cigarettes added with three different Phyllanthus emblica extracts

3 結論

①3 種不同溶劑的余甘子果實提取物中化學成分差異明顯，感官評價和提取得率結果均為：純水＞50%乙醇＞90%乙醇，確定了純水為最優(yōu)提取溶劑。②采用AB-8 型大孔吸附樹脂方法，利用純水洗脫，即可制備余甘子果實精制物；精制物中酚酸類成分得到有效富集，其中代表性成分沒食子酸的質(zhì)量分數(shù)顯著提高。③相較于余甘子果實粗提物，余甘子果實精制物在修飾卷煙煙氣、改善潤甜感、降低刺激和提高卷煙舒適性方面效果突出。本研究結果可為應用大孔吸附樹脂法開發(fā)天然植物香原料提供參考。