鲊肉粉中乳酸菌和葡萄球菌的篩選及鑒定

王曼，楊琛，覃曉玉，康孟杰，郝桂芳，王承明

(華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢，430070)

鲊肉粉是指將粉碎的秈米、豬肉、辣椒、鹽和香辛料混勻，在微生物作用下，發酵而成的傳統米肉復合制品，在我國鄂、湘、川、黔、渝等地區頗受歡迎，距今已有數千年的食用歷史[1-2]。目前，鲊肉粉制作以農家傳統制作方式為主，利用附著在原料表面的微生物進行發酵，無法保證產品穩定性和安全性。因此，篩選優良菌株對于鲊肉粉工業化生產、縮短發酵生產周期具有重要意義。

肉制品發酵菌種主要是乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌[3]，這2類微生物與發酵肉制品的顏色、質地、風味有很大關系[4]。乳酸菌可通過降低產品的pH值而延長食品的貨架期、抑制病原菌和腐敗菌生長[5]、縮短發酵周期，同時還可利用碳水化合物產生有機酸，賦予發酵產品獨特的酸味和口感[6]。葡萄球菌可以降解蛋白質和脂肪，形成特有的香氣和風味[7-9]，還具有抑制脂肪和蛋白質氧化，延緩發酵制品酸敗的作用。國內外對于葡萄球菌的研究已有諸多報道，在西式發酵香腸中木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)等是最具優勢的種類[10]，而在中式發酵香腸中表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和模仿葡萄球菌(Staphylococcussimulans)等更具有優勢[11]。此外，巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)和沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)也是發酵肉制品中常見的種屬。為了彌補單一菌株發酵的不足，通常將乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌進行復配，可以使產品風味更豐富。

本研究從自然發酵鲊肉粉中篩選發酵性能優良的乳酸菌和葡萄球菌，研究葡萄球菌的安全性和耐藥性、乳酸菌產酸能力和抑菌能力以及所有菌株的耐鹽性、耐亞硝酸鹽性等生物學特性，并通過形態特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定菌株，為鲊肉粉接種發酵提供優良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 實驗原料

鲊肉粉，實驗室自制；微量鑒定管，杭州濱河試劑公司；青霉素、復方新諾明、氯霉素、林可霉素、氨卡西林、卡那霉素、慶大霉素、四環素、紅霉素、環丙沙星，比克曼生物科技有限公司；革蘭氏染色試劑、16 g/L中性紅水溶液、1 g/L甲苯胺藍、NaCl、NaNO2等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 培養基

蛋白酶檢測培養基、脂肪酶檢測培養基、硝酸鹽還原培養基、氨基酸脫羧酶培養基[12]；MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基、MSA瓊脂培養基、NB肉湯培養基、DNA酶瓊脂、乙酰胺肉湯、脫纖維羊血、兔血漿，青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 儀器設備

分析天平(BS 224 S)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；酸度計(FE 20)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；生化培養箱(SPX-150BⅢ)，中國泰斯特儀器有限公司；可見分光光度計(722型)，上海菁華科技儀器有限公司；單人凈化工作臺(SW-CJ-1D)，蘇州凈化設備有限公司；全自動滅菌器(Zealway GR-60DA)，武漢遞熱愛生物科技有限公司；熒光顯微鏡(Leica DM 3 000)，德國Leica 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株初篩

首先對葡萄球菌進行安全性篩選。

溶血實驗：將葡萄球菌培養物接種于血平板上，37 ℃培養24 h，篩選無溶血圈的菌株。

凝固酶實驗：將葡萄球菌培養物接種到兔血漿中，37 ℃培養24 h，篩選無凝固酶的菌株。

DNA酶實驗：將葡萄球菌培養物接種于平板上，37 ℃培養24 h，在培養基表面滴加1 mol/L鹽酸，篩選無透明環的菌株。

藥敏性實驗：將菌液涂布于固體培養基上，將藥敏紙片放在培養基上，37 ℃培養24 h，篩選無耐藥性的菌株[13]。

將篩選出的葡萄球菌和乳酸菌進行如下實驗：

產黏實驗：挑取單菌落進行觀察，篩選不產黏的菌株。

發酵葡萄糖產氣實驗：滴加細菌培養物于葡萄糖產氣生化管中，37 ℃培養24 h，變黃者為陽性，無變化者為陰性，篩選產酸不產氣的菌株。

產氨實驗：將質控菌液加入乙酰胺肉湯中，37 ℃培養24 h，滴加鈉氏試劑3～5滴。呈磚紅色為陽性，呈黃色為陰性，篩選不產氨的菌株。

產H2S實驗：滴加細菌培養物于硫化氫生化管中，37 ℃培養24 h，變黑者為陽性，無變化者為陰性，篩選不產H2S的菌株。

過氧化氫酶實驗：滴加3%(體積分數)的H2O2溶液于細菌培養物的試管中，產氣泡為陽性，反之為陰性。

氨基酸脫羧酶實驗：37 ℃培養接種物24 h，呈紫色者為氨基酸脫羧酶試陽性，呈黃色為陰性，同時做氨基酸脫羧酶對照試驗，篩選無氨基酸脫羧酶的菌株。

1.2.2 菌株復篩

硝酸鹽還原酶實驗[14]：將培養物接種到培養基中，陰性仍為紫色，陽性則變成磚紅色，篩選硝酸鹽還原酶陽性菌株。

蛋白酶和脂肪酶水解實驗：蛋白酶和脂肪酶活性實驗參考趙俊仁等[15]的方法進行測定。

抑菌試驗：將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌涂布在MRS培養基上，打孔器打孔，加入50 μL乳酸菌離心上清液，37 ℃培養24 h，觀察抑菌圈大小。

拮抗實驗：在平板上進行十字交叉劃線，37 ℃培養24 h，觀察菌株生長情況。

1.2.3 優良菌株的生物學特性

生長曲線和產酸能力：參考潘曉倩等[16]的方法測定菌株生長曲線及產酸能力。

葡萄球菌耐酸性測定：將菌株分別接種到pH值為4、5、6、7、8、9的NB液體培養基中，37 ℃培養24 h后測其OD600值。

菌株耐鹽性測定：將菌株分別接種到含0%、2%、4%、6%、8%、10%(質量分數)NaCl的MRS、NB培養基，37 ℃培養24 h后測其OD600值。

菌株耐亞硝酸鹽性測定：將菌株接種到含0、50、100、150 mg/kg NaNO2的MRS、NB培養基，37 ℃培養24 h后測其OD600值。

1.2.4 優良菌株的鑒定

形態學鑒定：觀察培養基平板上的菌落形態，包括形狀、大小、顏色等。

16S rDNA鑒定：采用PCR擴增方法，送至江蘇金唯智有限公司測序，將測序序列與GenBank核酸序列數據庫進行BLAST同源性對比分析。

1.2.5 統計分析

每個實驗3次平行，用Origin 8.5軟件進行數據處理，MEGA 7.0軟件構建菌株的系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

從鲊肉粉中共分離純化出52株葡萄球菌和62株乳酸菌。首先對葡萄球菌進行安全性檢測，其中溶血陰性、血漿凝固酶陰性、DNA酶陰性、不具耐藥性的葡萄球菌36株。按照肉制品發酵劑篩選標準，對葡萄球菌和乳酸菌做一系列篩選實驗，篩選出不產黏、不產H2S、發酵葡萄糖不產氣、氨基酸脫羧酶陰性、硝酸鹽還原酶陽性的菌株，最終得到2株產細菌素、抑菌效果好的乳酸菌菌株，2株具有蛋白酶和脂肪酶活力的葡萄球菌菌株，篩選得到的4株菌株的實驗結果如表1所示。

表1 篩選葡萄球菌菌體形態及生理生化實驗結果Table 1 Results of mycelia morphology and physiological biochemical test

葡萄球菌的脂肪酶和蛋白酶活性有助于發酵肉制品特殊風味的形成；發酵肉制品中的乳酸菌需要無脂肪酶和蛋白酶活性[17]，如果其具有蛋白質降解活性，則可能縮短產品的貨架期，產生腐敗現象[18]，而具有脂肪降解活性的乳酸菌會使產品在儲存銷售過程中出現酸敗味[19]。實驗發現，S6、S7、A1、C7之間無拮抗作用，可作為鲊肉粉發酵菌株使用，將葡萄球菌與乳酸菌復配制成復合發酵劑，來彌補單一菌種發酵的不足。

2.2 優良菌株的生物學特性

2.2.1 菌株生長及產酸情況

將篩選得到的4株菌進行培養，分析生長情況，生長曲線如圖1-a所示，乳酸菌A1、C7和葡萄球菌S6、S7表現出相似的生長趨勢，0～2 h內為延滯期，從2 h后進入對數生長期，在10 h后進入生長平穩期，這表明篩選得到的乳酸菌和葡萄球菌具備良好的生長特性。快速產酸是衡量乳酸菌發酵劑品質的重要指標之一。產酸速率快可縮短發酵生產周期，并使乳酸菌迅速成為優勢菌群，抑制有害菌及致病菌的生長，提高產品的生物安全性[20]。由圖1-b可知，2株乳酸菌產酸能力較強，24 h內pH值由5.7下降至3.6，主要是對數期產酸較多。pH值迅速降低有利于抑制腐敗微生物的生長，保證肉制品品質。從生長性能和產酸速度2方面考慮，可以將乳酸菌A1和C7作為鲊肉粉的發酵菌種。

a-生長曲線；b-產酸能力圖1 菌株的生長曲線和產酸能力Fig.1 Growth curve and acid-producing capacity of strains

2.2.2 葡萄球菌耐酸性測定

在發酵肉制品中，通常需要將乳酸菌與葡萄球菌進行復配，制成復合發酵劑。因此，篩選的葡萄球菌應具有一定的耐酸性能，適應低pH值[21]。葡萄球菌在不同酸性條件的生長情況如圖2所示。

圖2 不同pH值下菌株的吸光度Fig.2 Comparison of tolerance of strains to difference pH value

隨著pH值由4增加到9，2株葡萄球菌的生長能力均呈現先增加后下降，在pH值為6時生長能力最強，其OD600值均達到1.5以上，在pH值4～5，2株葡萄球菌能較好生長，說明其能適應偏酸性的發酵環境，具有作為鲊肉粉發酵劑的潛力。

2.2.3 菌株耐食鹽性測定

發酵肉制品中含鹽量較高，添加量一般為6%(質量分數)。食鹽可以防腐、增強肉的保水力，同時也會對發酵菌株生長產生一定的影響，因此需要測試篩選菌株的耐鹽性。從圖3中可知，隨著NaCl質量分數的增加，菌株受到了不同程度的影響，生長力下降。乳酸菌A1和C7在NaCl質量分數為6%時生長良好，在NaCl質量分數為8%時吸光值在0.1左右，生長受到抑制。葡萄球菌S6和S7在NaCl質量分數10%時也能良好的生長，說明葡萄球菌S6和S7具有較強的耐鹽性。鲊肉粉中的NaCl質量分數為3%，因此，4株菌株都可以作為鲊肉粉的發酵菌株。

圖3 不同鹽含量下菌株的吸光度Fig.3 Comparison of tolerance of strains to difference concentration of NaCl

2.2.4 菌株耐亞硝酸鹽性測定

亞硝酸鹽可以改善發酵肉制品的色澤，一般要求用來生產肉品發酵劑的微生物可耐100 mg/kg NaNO2。從圖4可以看出，隨著NaNO2質量分數的升高，對乳酸菌A1和C7的生長抑制逐漸增強。在100 mg/kg時，菌株尚可良好生長，當NaNO2質量分數為150 mg/kg時，乳酸菌生長受到了嚴重的抑制。在0～50 mg/kg時，隨著質量分數的升高，對葡萄球菌S6和S7的抑制顯著增加，在50～150 mg/kg時，菌株的生長抑制變化小，這與劉夏煒[22]的研究結果一致。由此可知，4株菌株都可以作為鲊肉粉發酵菌株。

圖4 不同亞硝酸鹽添加量下菌株的吸光度Fig.4 Comparison of tolerance of strains to difference concentration of NaNO2

2.3 菌株鑒定

2.3.1 形態學特征

篩選菌株的菌落形態見表2，通過革蘭氏染色，鏡檢結果如圖5所示，乳酸菌A1、C7呈桿狀，葡萄球菌S6、S7呈串狀。

表2 四株菌的形態學特征Table 2 Morphological characteristics of four strains

圖5 菌株A1、C7、S6、S7革蘭氏染色顯微形態Fig.5 Gram staining micromorphology of strains A1,C7,S6,S7

2.3.2 菌株的16S rRNA序列測定及系統進化樹的構建

菌株的PCR產物凝膠電泳分析結果如圖6所示，擴增出約1 500 bp的DNA片段，條帶清晰，無雜帶。用MEGA 7.0構建系統發育樹，在GenBank中進行同源性比對，結果如圖7所示。A1、C7與GenBank中植物乳桿菌的16S rDNA序列相似性達99%以上，可初步確認為植物乳桿菌。

M-Marker；Y-陰性對照；1-A1；2-C7；3-S6；4-S7圖6 提取DNA模板的PCR擴增反應圖譜Fig.6 PCR amplification response spectrum of DNA template

a-植物乳桿菌A1、C7;b-沃氏葡萄球菌S6;c-巴氏葡萄球菌S7圖7 基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strains

菌株S6、S7的16S rRNA分別與GenBank中沃氏葡萄球菌、巴氏葡萄球菌的16S rDNA序列相似性達99%以上，可初步確認S6為沃氏葡萄球菌，S7為巴氏葡萄球菌。

3 結論

本研究從自然發酵鲊肉粉中篩選出4株發酵性能優良的菌株，通過16S rDNA序列分析可知，2株乳酸菌均為植物乳桿菌，2株葡萄球菌分別是沃氏葡萄球菌和巴氏葡萄球菌。植物乳桿菌A1、C7產酸能力強、生長速度快，葡萄球菌S6、S7耐酸且能產生脂肪酶和蛋白酶，4株菌對食鹽和亞硝酸鹽均具有較好的耐受性，研究結果為鲊肉粉接種發酵提供理論支撐。后期工作將篩選得到的菌株接種到鲊肉粉中，進行鲊肉粉的混菌發酵的進一步研究。