青魚肉活性肽的制備及其抗腫瘤活性研究

張耀，張露，劉俊，涂宗財(cái),2*

1(江西師范大學(xué) 國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心和江西省淡水魚高值化利用工程技術(shù)研究中心，江西 南昌，330022)2(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047)

抗腫瘤肽因具有低毒性、多樣性、低免疫原性和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)而被人們廣泛關(guān)注，制備方法主要有酶解法[1]、發(fā)酵法[2]和人工合成法[3]。由于發(fā)酵法技術(shù)不夠成熟且效果難以達(dá)到預(yù)期，人工合成法因技術(shù)要求高、工藝復(fù)雜、成本高等原因，均難以廣泛應(yīng)用。酶解法因具有反應(yīng)條件溫和、易控制、無有害化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生、酶解產(chǎn)物安全性較高等特點(diǎn)成為制備抗癌肽的首選方法。目前,已有許多從水生資源中酶解制備抗腫瘤肽的研究報(bào)道，但其原料主要來源于海洋產(chǎn)品，如藻類、深水魚類、軟體動(dòng)物、甲殼類和其他海洋副產(chǎn)品[4]，利用淡水魚制備抗腫瘤肽的相關(guān)研究較少。由于淡水魚的生長(zhǎng)環(huán)境與海洋生物的生長(zhǎng)環(huán)境有很大的區(qū)別，因此淡水魚蛋白質(zhì)的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和功能與海洋生物的蛋白質(zhì)有較大的區(qū)別，有可能開發(fā)出具有抗腫瘤活性的肽。目前僅在少數(shù)幾種淡水魚生物中有所提取，還有很大一部分淡水魚生物活性肽未被發(fā)現(xiàn)或開發(fā)出來，因此淡水魚生物活性肽具有非常廣闊的研究前景。研究表明青魚(Mylopharyngodonpiceus)具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)還養(yǎng)氣健胃，長(zhǎng)期食用青魚可有效緩解氣虛乏力、腳氣濕痹、頭暈無力等癥狀，且青魚肉的粗蛋白、總氨基酸和必需氨基酸含量為四大家魚中排行最高，而粗脂肪含量排第三，符合人們對(duì)高蛋白低脂肪食物的需求，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源[5]。

肽的抗腫瘤活性與多肽鏈長(zhǎng)度[6]、總體電荷/疏水性[7]、螺旋結(jié)構(gòu)[8]、氨基酸組成[9]和序列[10]等有關(guān)。已分離鑒定的抗腫瘤肽大多數(shù)是由3～25個(gè)氨基酸殘基連接而成的短肽。CHALAMAIAH等[11]對(duì)食源性抗腫瘤肽進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤肽活性主要與疏水氨基酸組成有關(guān)。DO等[12]發(fā)現(xiàn)，序列中的帶正電氨基酸(Lys、Arg和His)可增強(qiáng)抗腫瘤肽與帶負(fù)電的腫瘤細(xì)胞膜的有效結(jié)合。另外，自由基與癌癥的產(chǎn)生和發(fā)展密不可分[13]，具有抗氧化活性的物質(zhì)因其能夠清除自由基，避免活性氧損傷DNA等生物大分子等，可降低細(xì)胞突變率。如毛楷林[14]從皺瘤海鞘中提取了4種分子量的多肽組分，證實(shí)了多肽的抗腫瘤活性隨著抗氧化活性增強(qiáng)而增強(qiáng)。再者，疏水氨基酸含量高的多肽，通常也具有較好的抗氧化活性[15]，進(jìn)一步說明活性肽的抗腫瘤活性與抗氧化性具有一定的構(gòu)效關(guān)系。

相比其他淡水魚類，青魚肉中疏水氨基酸和帶電氨基酸含量相對(duì)較高[5]，具有制備抗腫瘤肽的研發(fā)潛力，然而從青魚肉中提取抗腫瘤肽的研究尚未見報(bào)道。本文以青魚肉為原材料，采用單因素試驗(yàn)、正交優(yōu)化試驗(yàn)確定制備青魚肉活性肽的最佳工藝，采用凝膠色譜對(duì)二步酶解物進(jìn)行初步分離，得到5個(gè)分子質(zhì)量不一的活性肽組分，檢測(cè)其氨基酸組成、抗氧化活性和抗腫瘤活性。本研究可豐富抗腫瘤肽的來源，為淡水魚資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮青魚購(gòu)買于江西省南昌市南昌縣長(zhǎng)勝市場(chǎng)。

胰蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司；復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶，江蘇銳陽生物科技有限公司；羥脯氨酸(131.13 Da)、抑肽酶(6 511.51 Da)、細(xì)胞色素C(12 384 Da)均為色譜純，北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)(分析純)，北京索萊寶科技有限公司；L-氧化型谷胱甘肽(612.63 Da)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)(色譜純)、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)(分析純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HepG2細(xì)胞，武漢普諾賽生命科技有限公司；CCK細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(ZP328-3)，北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基(RNBJ1457)，美國(guó)Sigma公司；胎牛血清(10091-148)、胰蛋白酶消化液(15140-122)，美國(guó)Gibco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；5430R型冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司；SR-AON-50型冷凍干燥機(jī)、SR160 W型二氧化碳培養(yǎng)箱，上海舍巖儀器有限公司；SKD-800型自動(dòng)凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；Acclaim PepMap 100型納流預(yù)柱、Acclaim PepMap RSLC型納流分析柱、EASY-nLC 1000型超高效液相，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；Synergy H1酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio Tek公司；L-8900型氨基酸分析儀，日本Hitachi公司；BHC-1300IIB2型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；N2000+色譜工作站，賽智科技(杭州)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 青魚肉采集

青魚肉糜制備工藝：

鮮活青魚→刮除魚鱗→宰殺(去頭去尾去鰭)→開膛去內(nèi)臟→剝皮去骨采魚肉→粉碎打成肉糜(常溫下，用粉碎機(jī)粉碎3次，粉碎時(shí)間7 s，間隔時(shí)間30 s)→-80 ℃冰箱中保存待用

1.3.2 堿性蛋白酶一步酶解

制備一步酶解物：

肉糜→加入純水混勻[料液比1∶10(g∶mL)]→調(diào)節(jié)初始pH值為8.00→添加堿性蛋白酶→水浴酶解(50 ℃，3 h)→滅酶(100 ℃，15 min)→離心(7 000 r/min，30 min)→取上清液冷凍干燥→青魚肉一步酶解物

1.3.3 蛋白酶的篩選

分別選用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)制備的青魚肉一步酶解物進(jìn)行酶解，各蛋白酶的適宜酶解條件如表1所示。以清除DPPH自由基的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)結(jié)合水解度(degree of hydrolysis，DH)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最優(yōu)蛋白酶用于二步酶解。

表1 五種蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of five proteases

1.3.4 青魚肉活性肽二步酶解工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

采用復(fù)合蛋白酶酶解一步酶解物制備高抗氧化活性的青魚肉活性肽，以清除DPPH自由基的IC50值和DH為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。依次評(píng)價(jià)pH值(6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)、酶解溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)、料液比(1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10，g∶mL)、酶添加量(2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g)、酶解時(shí)間(1、2、3、4、5 h)對(duì)青魚肉一步酶解物的酶解效果。

1.3.4.2 正交試驗(yàn)

選取pH值(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)對(duì)青魚肉一步酶解物酶解效果較強(qiáng)的3個(gè)因素為自變量，以IC50值為響應(yīng)值(Y)，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)，探索從青魚肉一步酶解物中制備具有高抗氧化活性肽的最佳工藝條件。

1.3.5 評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照涂宗財(cái)?shù)萚17]方法采用DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)比較青魚肉活性肽及其組分之間的抗氧化能力，采用Origin 8.6軟件中的多項(xiàng)擬合計(jì)算樣品清除50%的DPPH自由基所需質(zhì)量濃度(IC50，mg/mL)。

1.3.5.2 DH的測(cè)定

參照羅艷華等[18]方法測(cè)定二步酶解物中游離氨基氮和總氮含量。按公式(1)計(jì)算樣品的DH：

(1)

1.3.6 二步酶解物中多肽分子質(zhì)量分布的測(cè)定

參照李軍等[16]方法測(cè)定樣品中多肽的分布情況。將樣品配制成2.0 mg/mL的溶液，過0.22 μm水系濾膜后使用HPLC進(jìn)行分析。條件為：色譜柱，XBridge BEH 125? SEC；進(jìn)樣量，10 μL；柱溫，30 ℃；流動(dòng)相，V(乙腈)：V(水0.1%TFA)=40∶60；流速，0.5 mL/min。以2.0 mg/mL不同分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品及其出峰時(shí)間繪制相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線，通過相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線計(jì)算青魚肉活性肽的分子質(zhì)量。

1.3.7 Sephadex G-15分子篩層析

參照CAI等[19]方法采用Sephadex G-15分子篩層析對(duì)二步酶解物進(jìn)行初步分離。稱量40 g Sephadex G-15凝膠填料于干凈的燒杯中，加入超純水于室溫下浸泡24 h，使凝膠填料充分溶脹后裝入層析柱(16 mm×80 cm)中。待凝膠填料沉降至高度不再發(fā)生變化后，將活性肽粉末用超純水配成100 mg/mL的水溶液，濾膜過濾去除不溶物后取2 mL上樣。用恒流泵將超純水的流速調(diào)整為0.4 mL/min，紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)設(shè)定為220 nm，自動(dòng)收集器每5 min收集一管。

1.3.8 不同分子質(zhì)量多肽氨基酸組成分析

采用氨基酸分析儀對(duì)樣品的氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 體外抗腫瘤活性的測(cè)定

將樣品用培養(yǎng)基配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，過0.22 μm水系濾膜后備用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，外部加入PBS溶液防止細(xì)胞失水。加入細(xì)胞培養(yǎng)板時(shí)每孔細(xì)胞數(shù)約為5 000個(gè)，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)24 h后，移去殘余培養(yǎng)基，PBS溶液清洗2次。其中，實(shí)驗(yàn)孔中加入100 μL樣品(AS)，對(duì)照孔中加入100 μL的培養(yǎng)基(AC)，于37 ℃，5% CO2條件下孵育24 h。移去板內(nèi)樣品和培養(yǎng)基，PBS溶液清洗3次，加100 μL 體積分?jǐn)?shù)為5%的CCK-8溶液，于37 ℃培養(yǎng)3 h后在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔中細(xì)胞的吸光值。以CCK-8溶液在相同培養(yǎng)條件下的吸光值(Ab)作為底色對(duì)照[20]。按公式(2)計(jì)算細(xì)胞活力：

(2)

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Excel 2010記錄數(shù)據(jù)，SSPS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，使用Tukey HSD程序進(jìn)行差異顯著性分析，Origin 8.6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)酶的篩選

魚肉中的蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下會(huì)酶解成不同分子質(zhì)量的多肽，二步酶解不僅可以提高酶解效率和活性肽含量，還會(huì)進(jìn)一步將多肽水解成小分子質(zhì)量的短肽，提高肽的抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血糖等多種功能特性[21]。5 種蛋白酶的酶解效果如圖1所示，經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解之后，二步酶解物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，其IC50值為10.16 mg/mL，風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶的DH雖然較高，但其IC50值分別為16.87和27.17 mg/mL，抗氧化活性低于復(fù)合蛋白酶制備的活性肽，可能是由于酶切位點(diǎn)不同，部分具有抗氧化活性的結(jié)構(gòu)未被暴露或者被酶解破壞，導(dǎo)致抗氧化能力減弱。而中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的DH較低，水解物中具有抗氧化活性的肽較少，導(dǎo)致抗氧化活性較弱。由此可見，復(fù)合蛋白酶制備的二步酶解物具有更強(qiáng)的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)使用的復(fù)合蛋白酶主要是由堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)配而成，其酶解位點(diǎn)是疏水氨基酸[22]，通過堿性蛋白酶從中間切斷蛋白質(zhì)內(nèi)部的肽鏈釋放出具有抗氧化活性的肽段；其次，風(fēng)味蛋白酶將多肽鏈的末端切斷釋放單個(gè)氨基酸，酶解過程中與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生具有獨(dú)特風(fēng)味的天然香氣，從而改善食品的風(fēng)味[23]。與其他蛋白酶相比，復(fù)合蛋白酶更適用于肉類蛋白質(zhì)的水解和活性肽的制備。為了更好地制備高抗氧化活性的活性肽。因此，選擇復(fù)合蛋白酶用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的工藝優(yōu)化。

圖1 五種蛋白酶的酶解效果Fig.1 Enzymatic hydrolysis effect of five proteases注：不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2-a可知，二步酶解物的IC50值隨著pH值增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH為8.5時(shí)，二步酶解物的清除能力最強(qiáng)，IC50為6.42 mg/mL(P<0.05)，這是因?yàn)閺?fù)合蛋白酶中含有堿性蛋白酶的成分，在堿性環(huán)境中的酶活力高于酸性環(huán)境。pH低于或高于復(fù)合蛋白酶的最適pH范圍，都會(huì)使其酶解能力下降。由圖2-b可知，隨著酶解溫度的升高，二步酶解物的IC50值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，清除能力最強(qiáng)， IC50值為11.18 mg/mL。當(dāng)酶解溫度超過50 ℃時(shí)，IC50值逐漸增大，這是因?yàn)闇囟冗^高會(huì)導(dǎo)致復(fù)合蛋白酶的酶活力下降甚至失活，最終使蛋白水解效率降低。由圖2-c可知，隨料液比的增大，二步酶解物的IC50值呈先下降再上升后逐漸平穩(wěn)的趨勢(shì)，在料液比為2∶10(g∶mL)時(shí)，抗氧化活性達(dá)到最強(qiáng)(IC50=10.96 mg/mL)，此時(shí)的DH也較高。當(dāng)料液比繼續(xù)增大，IC50值呈上升的趨勢(shì)，原因在于底物濃度隨著料液比的增大而增大，底物過飽和，導(dǎo)致DH逐漸在下降，具有抗氧化活性的肽段含量也隨之降低。

由圖2-d可知，隨著酶添加量的增加，青魚肉的DH呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，IC50值顯著下降并趨于平穩(wěn)，當(dāng)酶添加量為6 000 U/g時(shí)， IC50值為12.06 mg/mL，這可能是因?yàn)镹-端或C端的疏水氨基酸含量增多，使其抗氧化活性增強(qiáng)[24]；如繼續(xù)增大酶添加量，IC50值下降不顯著(P>0.05)，可能是由于酶在水解多肽或者魚肉產(chǎn)生抗氧化肽的同時(shí)，也在水解具有抗氧化活性的小分子肽或多肽，導(dǎo)致產(chǎn)物活性并沒有顯著提高。由圖2-e可知，隨著酶解時(shí)間的增加，二步酶解物的IC50值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在當(dāng)酶解時(shí)間為3 h時(shí)，IC50值達(dá)到最小值(11.45 mg/mL)。酶與底物結(jié)合后迅速發(fā)生反應(yīng)，使得酶解液中DH和活性肽含量均上升，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，部分活性肽會(huì)被水解成游離氨基酸，使得具有抗氧化活性的多肽含量降低，其自由基清除能力下降。

a-pH；b-酶解溫度；c-料液比；d-酶添加量；e-酶解時(shí)間圖2 提取條件對(duì)二步酶解物的DH和DPPH自由基清除能力影響Fig.2 Effects of extraction conditions on DH and DPPH radical scavenging capacity of two-step enzymatic hydrolysate

2.3 二步酶解條件的正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

依據(jù)單因素結(jié)果，選取pH值(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)影響酶解效果較大的3因素，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)方案及清除DPPH自由基的IC50值結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and IC50value result of scavenging DPPH radical

以清除DPPH自由基的IC50值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)青魚肉活性肽的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。由表2可知，根據(jù)極差分析，各因素影響青魚肉水解物的DPPH自由基清除能力的大小順序?yàn)閜H值(A)>酶解時(shí)間(C)>酶解溫度(B)。二步酶解制備青魚肉活性肽的最優(yōu)組合為A1B2C2，即pH值為8.00，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間3 h。

2.3.2 最優(yōu)條件的驗(yàn)證

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳工藝條件進(jìn)行酶解，即pH 8.00，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間3 h，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，取平均值得到的清除DPPH自由基的IC50值為9.52 mg/mL，優(yōu)于未優(yōu)化之前的結(jié)果，故A1B2C2為最佳酶解工藝條件。

2.4 活性肽分子質(zhì)量分布情況

不同分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖如圖3所示，各標(biāo)準(zhǔn)品分離效果較好。通過線性回歸方程擬合發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lgMW)和保留時(shí)間(T)呈良好的線性關(guān)系，其相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線方程：lgMW=6.6 102-0.187 3T(R2=0.994 5)，依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線方程和活性肽的出峰時(shí)間，可計(jì)算出酶解物中活性肽的分子質(zhì)量范圍。

1-細(xì)胞色素C；2-抑肽酶；3-L-氧化型谷胱甘肽；4-羥脯氨酸圖3 不同分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatogram for different molecular weight standards

二步酶解物中活性肽的HPLC圖和分子質(zhì)量分布如圖4和表3所示，其中組分Ⅴ的分子質(zhì)量分布明顯小于單個(gè)氨基酸分子質(zhì)量且無法構(gòu)成多肽結(jié)構(gòu)，故不再對(duì)其進(jìn)行分析，因此青魚肉活性肽主要是由4種不同分子質(zhì)量多肽組分所組成。青魚肉活性肽分子質(zhì)量主要集中在組分Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，分子質(zhì)量在100～600 Da，均為小分子量肽。且組分Ⅳ含量最高，約占40.38%。根據(jù)二步酶解物中活性肽的分布情況，采用Sephadex G-15分子篩層析進(jìn)行分離純化。

圖4 二步酶解物的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of two-step enzymatic hydrolysate

表3 二步酶解物各組分的分子質(zhì)量和相對(duì)含量Table 3 Molecular weight and relative content of two-step enzymatic hydrolysate

2.5 Sephadex G-15分子篩層析

凝膠過濾主要是根據(jù)多肽的分子質(zhì)量進(jìn)行初步分離的一種技術(shù)，已被廣泛用于多肽的分離純化。二步酶解物洗脫后的圖譜及各組分含量如圖5和表4所示。從二步酶解物分離出5個(gè)組分，凍干后組分Ⅰ～Ⅴ分別占活性肽粉末的21.10%、14.86%、14.16%、28.11%和6.72%。組分Ⅳ含量最高(56.22 mg)，組分Ⅴ的含量較低，故綜合考慮時(shí)間、經(jīng)濟(jì)等因素，收集前面4個(gè)組分作為后續(xù)的研究對(duì)象。

圖5 二步酶解物的Sephadex G-15柱洗脫圖譜Fig.5 Elution chromatography of Sephadex G-15 column of two-step enzymatic hydrolysate

表4 各多肽組分的含量Table 4 Content of each peptide

2.6 氨基酸組成分析

二步酶解物及組分Ⅰ～Ⅳ含量如表5所示。二步酶解物中Glu含量最高，Asp、Leu、Gly的含量也相對(duì)較高，符合青魚魚肉的氨基酸組成特征[25]。二步酶解物的疏水氨基酸含量為32.92%，經(jīng)凝膠分離后，組分Ⅲ和組分Ⅳ的疏水氨基酸含量分別增加到35.07%和35.38%。

表5 二步酶解物及其各組分的氨基酸含量 單位：mol/kg

續(xù)表5

2.7 體外抗氧化及抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 DPPH自由基清除能力

二步酶解物及其各組分的DPPH自由基清除能力如圖6所示。在1.25～20 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，所有樣品都具有較好的DPPH自由基清除能力，且其抗氧化活性均隨樣品的質(zhì)量濃度增加而增加。由圖6可知，組分Ⅳ清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)(P<0.05)，IC50值為3.17 mg/mL，其抗氧化活性高于組分Ⅲ(IC50=3.43 mg/mL)、組分Ⅱ(IC50=4.86 mg/mL)、二步酶解物(IC50=9.57 mg/mL)和組分Ⅰ(IC50=12.90 mg/mL)。由表5可知，組分Ⅳ的疏水氨基酸含量最高，為其抗氧化活性提供保障；而二步酶解物的抗氧化能力強(qiáng)于組分Ⅰ，這是因?yàn)橐恍щ姲被幔浜康母叩鸵才c抗氧化活性有關(guān)，如Asp、Lys和His可以充當(dāng)電子供體并與自由基反應(yīng)，使其成為更穩(wěn)定的物質(zhì)，可阻止氧化反應(yīng)[26]。

圖6 二步酶解物及其不同組分的DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging a capacity of two-step enzymatic hydrolysates and their components

2.7.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

二步酶解物及其組分對(duì)HepG2的抑制能力如圖7所示，二步酶解物對(duì)HepG2細(xì)胞有較好的抑制，其抑制率為80.97%；經(jīng)過Sephadex G-15過濾色譜法分離純化后，組分Ⅳ對(duì)HepG2的抑制率大大提升，其抑制率達(dá)到92.54%(P<0.05)，由圖6可知，組分Ⅳ的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，表明活性肽的抗氧化活性和抗腫瘤活性存在一定的構(gòu)效關(guān)系，其細(xì)胞抑制率與抗氧化活性呈相似的趨勢(shì)，即抗氧化活性越好其細(xì)胞抑制率越高。有研究表明，活性肽的抗腫瘤活性和帶正電氨基酸(Lys、Arg和His)[19]有關(guān)，其含量越高，抗腫瘤活性越強(qiáng)。這可能是組分Ⅳ的帶正電氨基酸和抗氧化活性共同所致。而組分Ⅰ和組分Ⅱ?qū)epG2的抑制率卻下降，可能是由于其疏水氨基酸或帶電氨基酸少于其他組分，活性肽不能很好地與癌細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合并激發(fā)細(xì)胞內(nèi)通路，導(dǎo)致抗腫瘤活性下降。胡小軍等[27]從魷魚中篩選的抗氧化肽不僅具有較好的抗氧化活性，對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖也有明顯的抑制活性(IC50值為21.10 mg/mL)，表明抗氧化肽也具有一定的抗腫瘤活性。

圖7 二步酶解物及其不同組分對(duì)HepG2的抑制能力Fig.7 Anti-tumor activity of two-step enzymatic hydrolysate and their components on HepG2 cells

3 結(jié)論

以青魚肉為原材料，以清除DPPH自由基的IC50和DH為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出堿性蛋白酶-復(fù)合蛋白酶為制備青魚肉多肽的最優(yōu)酶解組合。通過優(yōu)化確定制備青魚肉活性肽的最佳工藝條件為：pH為8.00、酶解溫度為50 ℃、料液比為2∶10(g∶mL)、酶添加量為6 000 U/g、酶解時(shí)間為3 h。此時(shí)，酶解物的清除DPPH自由基的IC50值為9.52 mg/mL，主要由分子質(zhì)量范圍集中在130～1 397 Da的4個(gè)肽組分組成。肽組分I-Ⅳ都具有一定的抗氧化能力，其中組分Ⅳ的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，IC50為3.17 mg/mL，當(dāng)組分Ⅳ質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率為92.54%，表明制備的青魚肉多肽同時(shí)具有抗氧化和抗腫瘤活性。