茯苓提取物參與灰樹花液態深層發酵及對其活性物質產量的影響

吳力亞，吳天祥，汪玲

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)2(貴州食品工程職業學院，貴州 貴陽，550025)

灰樹花(Grifolafrondosa)是一種藥食兩用真菌[1-2]，含有豐富的生物活性成分，如多糖、黃酮、多酚、蛋白質、麥角甾醇、真菌SOD酶等[3-5]，尤其多糖組分具有很高的藥用價值，如抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、降血糖[8]、降血脂[8-9]、提高機體免疫活性[6,10]等。利用中藥與真菌進行共發酵是一種新的生物轉化技術，趙亮等[11]在灰樹花發酵體系中，添加苦蕎的乙醇提取液，對灰樹花生物量和次級代謝產物有一定的促進作用；楊海龍等[12]探究篩選了不同中藥提取液對靈芝深層發酵的影響；盧紅云等[13]通過向灰樹花液體培養基中加入天麻醇提物，促進了灰樹花纖維素酶、淀粉酶、漆酶等酶的活性，其活性的大小與灰樹花的生長和代謝產物積累具有一定的關聯。本課題組前期研究顯示，添加一定比例的天麻醇提物能夠顯著地提高灰樹花生物量和多糖的產量，并且與未添加組相比，能夠顯著提高多糖的生物活性[6,14]，如抗氧化、降血糖、降血脂、提高機體免疫力等[15]。

茯苓為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，含β-茯苓聚糖和三萜類化合物(乙酰茯苓酸、茯苓酸、3β-羥基羊毛甾三烯酸)[3,16-18]。LI 等[19]喂食小鼠茯苓粗提物及茯苓三萜類化合物，能夠改善糖尿病小鼠的血糖水平;TIAN 等[20]的研究表明，茯苓多糖能夠通過調節TLR4/TRAF6/NF-κB信號通路進而表現出免疫調節作用。本實驗的目的是向灰樹花液態深層發酵培養基中添加不同比例、不同溶劑提取的茯苓提取物，探究對灰樹花生物量及次級代謝產物的影響，以期探究一種茯苓提取物的最適添加比例，進而為茯苓參與真菌液態深層發酵提供思路及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花(Grifolafrondosa，菌種編號：5.404)，中國普通微生物菌種保藏管理中心；茯苓，北京同仁堂參茸中藥制品有限公司；蘆丁標標準、牛血清白蛋白標標準、考馬斯亮藍G-250，北京索萊寶生物科技有限公司；沒食子酸標準品，天津科密歐化學試劑有限公司；無水硝酸鋁、亞硝酸鈉，上海阿拉丁試劑有限公司；其他試劑均為市售分析純。

斜面培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養基。

液體種子培養基(g/L)：葡萄糖 30，KH2PO40.5，蛋白胨 2，MgSO4·7H2O 0.5，酵母膏 6，pH 自然。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖 50，KH2PO40.5，蛋白胨 5，MgSO4·7H2O 2，酵母膏 10，pH 自然。

1.2 儀器與設備

BXM-30 R型立式滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；RE—2000A型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-1D型凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機，長沙邁佳森儀器設備有限公司；ZWY-C2112 B型雙層旋轉式可編程恒溫恒濕搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；CTFD-12S型真空冷凍干燥機，青島永合創信電子科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 灰樹花菌種培養方法

斜面種子培養：從母種試管中挑取黃豆粒大小菌絲塊接種于PDA培養基斜面中部，25 ℃恒溫培養，至菌絲長滿整個斜面，轉置4 ℃保存。

液體種子培養：用接種勺在斜面菌種管中刮取1勺細小菌絲體,接種于液體種子培養基中，250 mL三角瓶裝液量為100 mL種子液，加入少許細小玻璃珠，于25 ℃、150 r/min搖床中培養6 d。

發酵培養：無菌條件下，按體積分數為10%的接種量，移取10 mL種子液接于發酵培養基中，250 mL三角錐形瓶裝液量為100 mL發酵液,于25 ℃、150 r/min搖床中培養12 d。

1.3.2 茯苓提取液的制備

茯苓粉的制備：取茯苓菌核，50 ℃烘箱內烘干，粉碎機粉碎，過80目篩。

茯苓水提液的制備：取20 g茯苓粉末，加200 mL蒸餾水，90 ℃條件下回流提取4 h，抽濾得上清液，粉末繼續回流提取，重復3次，合并上清液，減壓濃縮蒸發至200 mL，即得0.1 g/mL的茯苓水提液。

茯苓醇提液的制備：取20 g茯苓粉末，加200 mL體積分數為75%的乙醇溶液，70 ℃條件下回流提取4 h，抽濾得上清液，粉末繼續回流提取，重復3次，合并上清液，減壓濃縮蒸發至200 mL，即得0.1 g/mL的茯苓醇提液。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量的測定

灰樹花生長以其菌絲體生物量為指標。將發酵培養后的培養基用濾紙過濾，收集菌絲體，蒸餾水沖洗3次并于60 ℃烘箱中烘干至恒重，稱取質量，即為菌絲體生物量。

1.4.2 多糖含量的測定[21]

(1) 胞外多糖的測定：取5 mL上述濾液，加入4倍體積的95%乙醇，于4 ℃冰箱中靜置24 h，6 000 r/min離心15 min后收集沉淀，用95%乙醇重復洗滌，最后于60 ℃烘干，加蒸餾水復溶，作為待測樣品溶液，用苯酚硫酸法測定胞外多糖的含量。

(2) 胞內多糖的測定：精確稱取1 g菌絲體粉末，加入50 mL蒸餾水，超聲提取5 h，過濾收集濾液，加蒸餾水定容到50 mL，作為待測樣品溶液，用苯酚硫酸法測定胞內多糖含量。

1.4.3 蛋白含量的測定[22]

(1) 胞外蛋白含量的測定：取100 mL上述濾液，濃縮后并加蒸餾水定容到10 mL，作為待測樣品溶液，用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。

(2) 胞內蛋白含量的測定：精確稱取1 g菌絲體粉末，加入50 mL蒸餾水，超聲提取5 h，過濾收集濾液，加蒸餾水定容到50 mL，作為待測樣品溶液，用考馬斯亮藍法測定胞內蛋白含量。

1.4.4 總黃酮含量的測定[23]

(1) 胞外總黃酮含量的測定：取100 mL上述濾液，減壓濃縮并加蒸餾水定容到10 mL，作為待測樣品溶液，采用NaNO2、Al(NO3)3顯色法測量，總黃酮含量以蘆丁當量表示。

(2) 胞內總黃酮含量的測定：精確稱取1 g菌絲體粉末，加入50 mL 70%的乙醇，超聲提取5 h，過濾收集濾液，加70%乙醇定容50 mL作為待測樣品溶液。

1.4.5 發酵液還原糖[24]及pH的測定

取1 mL上述過濾后的濾液，用蒸餾水定容至50 mL，取1 mL稀釋液于25 mL的具塞比色皿中，加1 mL蒸餾水，再加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，搖勻后，沸水浴加熱5 min，冷卻至室溫定容至25 mL，于540 nm處測定吸光值。

1.5 數據處理與分析

實驗數據用平均值±標準偏差(n±SD)表示(n=3)。使用Origin 10 軟件畫圖，SPSS 19.0軟件進行數據分析。使用單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗進行顯著性分析，P<0.05表示數據具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同茯苓提取物添加量對灰樹花菌絲體的影響

向灰樹花液態發酵培養基中添加不同比例的茯苓醇提物和水提物，兩者添加比例對灰樹花生物量的影響如圖1所示。隨著添加物質量濃度的增加，生物量表現先增大后減小的趨勢，在茯苓醇提液添加量為5 g/L和茯苓水提液為7 g/L時對其生物量影響顯著(P<0.05)，達到最大生物量，分別為(1.505±0.03)g/L和(1.573±0.06)g/L，相較于空白組分別提高了24.28%和29.04%，說明一定質量濃度的茯苓醇提物和水提物參與灰樹花發酵能夠促進灰樹花的生長。

圖1 不同茯苓提取物添加量對灰樹花生物量的影響Fig.1 Effect of different additions of Poria cocos extract on the biomass of Grifola frondosa注：**P<0.05,##P<0.05;表示與空白組(0 g/L)相比具有顯著差異

2.2 不同添加量的茯苓提取物對灰樹花胞外和胞內多糖產量的影響

由圖2可知，不同茯苓提取物的添加比例，對灰樹花胞外多糖的分泌及胞內多糖的產生具有先升高后降低的趨勢。

圖2 不同茯苓提取物添加量對灰樹花多糖產量的影響Fig.2 Effect of different additions of Poria cocos extract on the yield of polysaccharide of Grifola frondosa注：**P<0.05,##P<0.05,++P<0.05,分別表示與空白組(0 g/L)相比具有顯著差異

在茯苓醇提物為5 g/L時，對灰樹花胞內和胞外多糖的產生均有顯著的促進作用(P<0.05)，且醇提物的促進作用高于水提液，分別達到最大多糖產量[胞內(4.15±0.079)%和胞外(1.434±0.02) g/L]，相較于空白組[胞內(3.19±0.066)%和胞外(1.217±0.016) g/L)]分別提高了30.09%和17.8%，多糖產量的增加可能是茯苓提取液中的某些成分影響了參與灰樹花多糖合成代謝酶的活性，也可能是灰樹花產生的胞外酶對提取液主要成分進行了分解，作為營養物質，提供自身生長代謝的需求。由于茯苓中含有大量的多聚糖，為了降低茯苓多糖對多糖檢測造成干擾，故不把茯苓水提液作為影響胞外多糖產量的一個因素。茯苓水提物在7 g/L添加量時對胞內多糖分泌具有顯著促進作用(P<0.05)，胞內多糖產量為(3.88±0.106)%，與空白組(3.24±0.032)%相比提高了19.8%，所以適宜質量濃度的茯苓提取物參與灰樹花發酵時，均能夠促進多糖的產生，高質量濃度的茯苓提取物對其多糖產生具有抑制作用，這與本課題組的研究課題天麻參與灰樹花液態發酵的促進趨勢相類似[25]。

2.3 不同添加量的茯苓提取物對灰樹花胞外和胞內蛋白產量的影響

由圖3可知，茯苓提取物對灰樹花胞外、胞內蛋白的產量均有一定的影響，與黃忠等[26]采用天麻參與灰樹花發酵趨勢相似。醇提物在5 g/L時與空白組相比，對其胞外和胞內蛋白產量均有最顯著的促進作用(P<0.05)，胞外和胞內蛋白產量分別為(55.28±0.219)mg/L和(4.597±0.172)%，相較于空白組胞內和胞外蛋白(50.03±0.006)mg/L和(4.17±0.056)%分別提高了10.49%和10.24%。水提液在添加量為7 g/L和9 g/L時，分別對胞外和胞內蛋白的產量具有顯著的促進作用(P<0.05)，在水提液最適添加量時，胞外和胞內蛋白的最佳產量為(55.152±0.029)mg/g和(4.536±0.029)%,相較于空白組胞內和胞外(50.026±0.014) mg/L和(4.17±0.056)%分別提高了10.24%和8.78%。總體來說，茯苓水提物促進效果略低于茯苓醇提物的效果，可能原因是茯苓里的藥用活性成分更容易溶于有機溶劑，活性成分含量高于茯苓水提物。

圖3 不同茯苓提取物添加量對灰樹花蛋白產量的影響Fig.3 Effect of different additions of Poria cocos extract on the yield of protein of Grifola frondosa注：**P<0.05,##P<0.05,++P<0.05,aa P<0.05,分別表示與空白組(0 g/L)相比具有顯著差異(下同)

2.4 不同添加量的茯苓提取物對灰樹花胞外和胞內總黃酮產量的影響

由圖4可知，在茯苓提取物添加量在0～11 g/L范圍內，對灰樹花胞外和胞內總黃酮的產量均有一定的促進作用(P<0.05)，且隨著添加物質量濃度的升高，促進作用表現出先升高后降低的趨勢。總體看來，在醇提物添加量為5 g/L時，對灰樹花胞外和胞內總黃酮具有顯著的促進效果(P<0.05)，分別為胞外和胞內(11.279±0.473)mg/L和(2.5±0.02)%,相較于空白對照組胞外和胞內(10.413±0.278) mg/L和(2.27±0.03)%，分別提高了8.32%和10.13%。水提物在添加量為7 g/L時，對灰樹花胞外和胞內總黃酮具有顯著的促進作用(P<0.05)，分別為胞外和胞內(10.55±0.03) mg/L和(2.47±0.01)%，相較于空白對照組胞外和胞內(10.227±0.09) mg/L和(2.26±0.07)%,分別提高了3.16%和9.29%，與醇提物在添加量為5 g/L時的促進作用相比，略低于5.16%和0.84%。

圖4 不同茯苓提取物添加量對灰樹花總黃酮產量的影響Fig.4 Effect of different additions of Poria cocos extract on the production of total flavonoids of Grifola frondosa

2.5 不同添加量的茯苓提取物對灰樹花發酵液還原糖和pH的影響

由以上研究結果可知，茯苓醇提物和茯苓水提高物在添加量分別為5和7 g/L時，對灰樹花生物量和胞外、胞內次級代謝產物的產量具有顯著的促進作用，因此，分別選擇這2種添加比例作為研究對象，對茯苓提取物參與灰樹花液態深層發酵過程中發酵液中還原糖含量和pH的動態變化進行測定，可更好地反映灰樹花在整個生長代謝過程中對外界營養物質吸收利用狀況，為探究其代謝產物積累的條件提供一定的參考。由圖5可知，在灰樹花0～12 d的整個發酵過程中，發酵液的還原糖含量始終是減少的，且茯苓提取物添加組還原糖的減少速度略慢于空白對照組，可能是茯苓提取物的某些成分在其發酵過程中作為一部分碳源被菌絲吸收利用，從而減緩了發酵液中還原糖的利用。總的來看，在發酵初期(0～3 d)，還原糖的降低趨勢緩慢，說明在此段時間，菌絲體處于環境適應期，對葡萄糖的利用程度很小，在發酵的4～8 d，還原糖含量降低趨勢加快，說明在此段時間，菌絲體處于快速生長階段，此時是活性代謝產物積累最大的時期。在發酵的9～12 d，還原糖含量降低趨勢緩慢，基本無變化，且發酵液開始變渾濁，部分菌絲體開始發生自溶現象，說明在此段時間，灰樹花生長達到衰退期，對葡萄糖基本無吸收。

圖5 5 g/L的茯苓提取物添加量對發酵液還原糖含量的影響Fig.5 Effect of 5 g/L Poria cocos extract on the reducing sugar content of fermentation broth

如圖6所示，發酵液的pH變化趨勢與還原糖變化趨勢具有一定的相關性。原因是，灰樹花利用還原糖進行自身生長代謝合成代謝產物時，通過糖酵解途徑產酸(主要為乳酸、有機酸)，使得發酵液酸度增大，pH值降低。外界pH通過影響細胞的膜滲透對細胞的生長代謝具有一定的影響效果[27-28]，通過對灰樹花發酵過程pH的動態監測，可以通過調節其發酵過程中pH值變化，更好地促進菌絲的生長和代謝產物的積累。

圖6 5 g/L的茯苓提取物添加量對發酵液pH的影響Fig.6 Effect of 5 g/L Poria cocos extract on the pH of fermentation broth

3 結論

本實驗將中藥茯苓的不同溶劑提取物和不同添加比例加入到真菌灰樹花的液態深層發酵液中，參與灰樹花的生長代謝過程，將中藥與藥用真菌有機結合并探究茯苓對灰樹花活性代謝產物積累的促進作用。結果表明,茯苓醇提物在5 g/L的添加比例及茯苓水提液在7 g/L的添加比例時對灰樹花生物量、多糖、總黃酮、蛋白具有最顯著的促進作用，其中多糖的增加率較高，而總黃酮和蛋白的增加率較低。具體為5 g/L醇提物添加條件下灰樹花胞外多糖、胞內多糖、胞外黃酮、胞內黃酮、胞外蛋白、胞內蛋白與空白組相比具有顯著促進作用(P<0.05),分別提高了17.8%、30.29%、8.32%、10.13%、10.49%和10.24%。7 g/L水提液添加條件下，灰樹花胞內多糖、胞外黃酮、胞內黃酮、胞外蛋白、胞內蛋白與空白組相比具有顯著促進作用(P<0.05),分別提高了19.8%、3.16%、9.29%、10.24%和8.78%。本文驗證了茯苓提取物在適宜的添加比例下能在一定程度上促進灰樹花某些活性產物的含量，為中藥參與食用菌液態深層發酵促進代謝產物的產量提供理論指導，促進中醫藥新藥制劑的創新和食用菌產業的深加工發展。后期將主要對茯苓提取物的具體化學組分參與灰樹花深層發酵的機理及茯苓提取物參與灰樹花發酵是否提高其代謝產物的生物活性方面進行研究。