枸杞酒釀造過程中的酚酸降解規律

耿嘉鈺，程煥,2，張惠玲*

1(寧夏大學 農學院，寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川，750021)2(浙江大學 生物系統工程與食品科學學院，智能食品加工技術與裝備國家地方聯合工程實驗室，浙江省農產品加工技術研究重點實驗室，浙江省健康食品制造與品質控制國際合作基地，浙江大學馥莉食品研究院，浙江 杭州，310058)

枸杞(LyciumbarbarumL.)作為傳統藥食兩用植物，已逐漸成為健康食品并被國內外市場接受[1]。研究顯示，枸杞除多糖、甜菜堿和維生素外，還富含多酚類物質，因此具有較強的抗氧化、降低膽固醇的能力[2]。枸杞中多酚類物質主要包括酚酸、花青素[3]、酚酸與多胺形成的酚酸酰胺等植物次生代謝物及其復合物[4-5]。枸杞酒作為枸杞深加工中發展最迅速的產品之一，逐漸被更多消費者接受[6]。枸杞發酵酒酒精含量低，在保留枸杞原有的營養成分基礎上，還具有典型性香氣特征，十分適合貧血、睡眠質量不佳的人群飲用[7]。酚酸在微生物的作用下轉化為酒的重要香氣成分，其中的芳香族化合物通過酵母菌發酵從兒茶素、綠原酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸等物質中轉化而來[8]。MATHEW等[9]研究顯示，阿魏酸可以被酵母菌、霉菌和細菌轉化為具有特殊香氣的4-乙烯基苯酚和香蘭素。

目前對枸杞中酚酸物質的研究多集中于酚酸物質的提取、鑒定和抗氧化能力等方面。呂海洋等[10]在寧夏枸杞中鑒定出28種多酚類物質，并首次鑒定出7種香豆酸糖苷衍生物;INBARAJ等[11]研究發現，寧夏枸杞含有槲皮素、酚酰胺及香豆酸化合物，其種類和含量都很豐富；而FORINO等[12]首次在枸杞中發現阿魏酸與酪胺形成的二聚體，并認為是枸杞中含量最高的酚類物質;ISABEL等[13]用四級桿串聯飛行時間譜從寧夏枸杞中鑒定出包括綠原酸、對香豆酸、槲皮素及其衍生物等31種多酚類化合物；RODRIGUES等[14]測定了枸杞干果和枸杞膠囊中多酚的組成，發現共有8種具有生物活性的酚酸和2種黃酮類化合物，含量分別為55.5～83.7 mg/kg和172.3～2 982.4 mg/kg。目前，人們對酚酸單體物質在枸杞酒發酵過程中的變化研究較少，因此本實驗通過研究不同預處理及發酵過程中酚酸的降解情況，探究枸杞酒釀造過程中酚酸含量的變化及其相應降解產物。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

枸杞，寧夏百瑞源枸杞股份有限公司；果膠酶(酶活力≥60 000 U/g)，浙江博丹衡食品配料有限公司；偏重亞硫酸鈉，食品級，河南千志商貿有限公司；白砂糖，食品級，當地超市；法國釀酒干酵母，法國Lamothe-Abiet公司。

1.1.2 實驗試劑

環己醇(色譜純)、無水乙醇(色譜純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、正己烷(色譜純)、二氯甲烷(色譜純)、丙酮(色譜純)、甲酸(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；色譜級酚酸標準品包括兒茶酸、咖啡酸、香豆酸、綠原酸、丁香酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸，阿拉丁(中國，上海)試劑公司。

1.1.3 儀器與設備

MS105DU電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；DT35手持糖度儀，上海淋譽公司；SHJ-6AB磁力攪拌水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；3K15離心機，美國Sigma-Aldrich公司；RE-52旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；Waters e2695高效液相色譜分析儀，美國Waters公司；手動固相微萃取(SPME)裝置，美國Supelco公司；Agilent7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SPX-250B-Z 生化培養箱，上海博迅實業有限公司；PB-LO pH計，賽多利斯科學儀器有限公司；JYK-C051九陽榨汁機，中國杭州九陽小家電有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞汁的制備

枸杞干果用蒸餾水沖洗干凈，料液比為1∶5(g∶mL)，加入54 mg/L的偏重亞硫酸鈉，浸泡6 h后打漿，加入40 mg/L的果膠酶于40 ℃恒溫水浴4 h，分裝于錐形瓶中備用。

1.2.2 枸杞汁預處理條件設定

枸杞酒釀造前，必須對枸杞汁先進行預處理，即酶解、滅菌、調節pH。參考趙璐[15]的方法對5個不同預處理條件進行分析，實驗均在避光以及充CO2隔氧的條件下進行，并立即分別取10 mL樣品置于棕色瓶中封口待測。

對照組：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后立即取樣測定。

果膠酶處理組：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后，按比例加入40 mg/L果膠酶酶解2 h后取樣。在此期間保證燒杯充滿CO2。

調節pH組：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后，測得原汁的pH為4.8，用檸檬酸調整其pH為3.3后取樣。

高壓滅菌組：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后，在0.10～0.15 MPa，121～126 ℃滅菌條件下滅菌30 min后立即取樣測定。

偏重亞硫酸鈉組(SO2滅菌組)：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后，加入54 mg/L偏重亞硫酸鈉，使游離SO2的質量濃度達到60 mg/L，放置1 h后立即取樣測定。

光照處理組：將枸杞干果和蒸餾水按1∶5(g∶mL)的料液比放入干凈的榨汁機中，快速進行機械破碎后，然后放置在自然光下分別照射1、2、3、4 h，分別取樣測定。

1.2.3 枸杞酒的釀造

取1.2.1小節中制備的枸杞汁，調節糖度為25°Bx，pH為3.3，接種酵母(0.20 g/L)，18 ℃發酵，每天取樣進行糖度、pH值和酒精度的測定，數值穩定時終止發酵。取發酵后的酒樣存于-80 ℃冰箱待測。

1.2.4 酚酸含量測定

參考馬先紅等[16]和ADOM等[17]的方法，并做適當修改。準確稱取10 mL枸杞汁或枸杞酒樣品于50 mL離心管中，加入30 mL 體積分數為80%冰乙醇后于搖床振蕩提取15 min。提取結束后在2 500 r/min離心10 min。移出上清液，殘渣再提取2次，合并3次上清液，用0.45 μm濾膜過濾。將過濾后的上清液放置在旋轉蒸發儀中，設置45 ℃，在真空條件下蒸干，并用甲醇定容至10 mL。使用0.22 μm濾膜過濾后保存于-80 ℃，用于酚酸物質含量的測定。

使用高效液相色譜(hight performance liguid chromatography,HPLC)系統測定枸杞汁或枸杞酒中酚酸含量：色譜條件參考WU等[18]的方法并作適當修改。取酚酸提取液與混和標準品溶液分別注射10 μL于HPLC系統中，反相C18柱(ZORABX SB-C18,250 mm×4.6 mm)用于色譜分離。使用雙流動相梯度洗脫，包括甲醇(A相)和體積分數為0.1%甲酸水溶液(B相)，洗脫程序為：0～8 min,15%～20% A;8～18 min,20%～60% A;18～30 min,60%～80% A;30～40 min,80% A;40～50 min,80%～15% A。流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長設為288和330 nm。通過對比各標準品的保留時間和峰面積，確定樣品中酚酸的組成和含量。

1.2.5 酚酸標準曲線繪制

避光準確稱取兒茶素、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸標準品各2.00 mg，分別溶于冰乙醇中，待樣品完全溶解，用甲醇定容到10 mL容量瓶中，4 ℃儲存待用。進樣前進行梯度稀釋，并以各物質質量濃度為X軸，峰面積為Y軸建立線性回歸方程，結果如表1所示。

表1 酚酸線性回歸方程Table 1 Phenolic acid linear regression equation

1.2.6 建立模擬體系

以單純的酵母菌在糖液中發酵做模擬體系，分別加入酚酸標準品進行酵母菌發酵，測定發酵后物質的變化與降解產物。參考文獻[19]的方法配制與枸杞酒發酵環境相似的YPD培養基，準確稱取蛋白胨20 g/L，加入1 000 mL蒸餾水，添加適量葡萄糖將培養基糖度調整為糖度25°Bx，調節培養基pH為3.3，121 ℃高壓滅菌30 min后冷卻到18 ℃左右。在無菌條件操作下，分別加入0.50 g各個酚酸標準品，接種酵母(0.2 g/L)于YPD培養基中，震蕩搖勻后，于18 ℃恒溫培養至培養液糖度不再變化，終止發酵，取樣待測。

1.2.7 酚酸降解的揮發性物質測定

1.2.7.1 GC-MS分析[1]

色譜條件：DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度為250 ℃，解吸時間5 min，用于GC-MS分析。載氣為高純氦氣(99.999%)，氣體流量為1.5 mL/min，不分流。程序升溫：起始溫度35 ℃，保持3 min；以3 ℃/min的升溫速度升至40 ℃，保持1 min；再以5 ℃/min的升溫速度升至210 ℃，保持10 min。

質譜條件：接口溫度270 ℃，離子源溫度為230 ℃，EI為電離源，電子能量為70 eV，燈絲流量為0.20 mA，檢測器電壓為350 V，掃描范圍為45～450 Amu。

1.2.7.2 定性定量分析

定性分析：分析結果運用NIST譜庫進行初步檢索和分析，再結合相關文獻進行人工譜圖解析，進而確認各個待測組分的化學組成。

定量分析：采用內標環己酮(質量濃度為0.285 μg/mL)進行相對定量分析。即假設各物質響應頻率和內標物質相同，通過待測組分與內標物質峰面積之比，計算待測物質的含量(μg·mL-1)。計算方法如公式(1)：

待測物質質量濃度=

(1)

1.3 數據處理與統計分析

采用SPSS 20.0和Excel分析和處理數據，單向方差分析(ANOVA)區分樣品之間的顯著差異，數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中酚酸單體分析

通過對照標準品與高分辨質譜分析，從枸杞汁和枸杞酒色譜峰中共確定了7種酚類物質單體。根據相應化合物的標準曲線方程，計算7種酚酸單體的含量，如表2所示。

表2 枸杞酒中酚酸物質組成及顯著性分析 單位：μg/mL

實驗結果顯示，7種酚酸單體物質在發酵前期(0～4 d)含量呈上升趨勢，在發酵第4～5 天達到峰值。原因是發酵前期，酵母菌大量繁殖，釋放出大量酶,使得枸杞汁中的酚酸物質釋放出來，從而使得各單體酚酸含量上升。發酵中期(4～6 d)時，因為酚酸結構不穩定，極易受外界環境如發酵溫度、光照、氧化等影響發生降解[21]，且隨著酚酸物質不斷氧化縮合，各單體酚酸含量均出現下降趨勢。而在發酵后期(6～12 d)，發酵體系達到穩定狀態，因此酚酸含量變化不大。

2.2 不同預處理對酚酸物質的影響

2.2.1 對酚酸含量的影響

由圖1看出，與對照組相比，調節pH時，只有咖啡酸含量變化較為明顯，增長約為3.06倍；果膠酶處理組中有咖啡酸、阿魏酸、對羥基苯甲酸和丁香酸的含量變化明顯，其含量分別增長約為5.78、3.34、2.60和2.50倍；光照處理時，只有咖啡酸含量變化較為明顯，增長約為2.67倍；高壓滅菌處理時咖啡酸、阿魏酸和兒茶素的含量變化明顯，其含量分別增長約為10.48、6.00和3.12倍；SO2滅菌時只有咖啡酸含量變化較為明顯，增長約為3.37倍。

圖1 不同預處理對枸杞汁中酚酸含量的影響Fig.1 Effects of different pretreatments on phenolic acid content in goji juice

2.2.2 枸杞汁中酚酸降解產物

由表3看出，5個不同條件下都測到了降解產物，其中酚酸經過果膠酶處理后生成的降解產物種類最多，分別為2,5-二甲基吡嗪、苯乙酮、4-乙基愈創木酚、苯乙酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、丙酸和異丁酸乙酯。偏重亞硫酸鈉組次之，產生了2,5-二甲基吡嗪苯乙酮4-乙基愈創木酚、2,4-二叔丁基苯酚、丙酸、異丁酸乙酯；高壓滅菌處理后的枸杞汁，檢測到的酚酸降解產物最少，只有2,5-二甲基吡嗪、苯乙酮和2,4-二叔丁基苯酚。說明果膠酶破壞分子鍵的化學作用和偏重亞硫酸鈉的還原作用，比高壓滅菌的物理作用強。

2.3 枸杞酒發酵中酚酸變化規律

由表4看出，發酵前后，酚酸中含量變化最大的是咖啡酸，其次是丁香酸，變化最小的是兒茶素。說明雙鍵含量越多，越不穩定。實驗測定含量相對較多的降解物有6種，分別為2,5-二甲基吡嗪、苯乙酮、4-

表3 不同預處理條件下酚酸降解產物 單位：μg/mL

乙基愈創木酚、苯乙酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚和乙酸異戊酯。7種酚酸都在最不穩定的雙鍵位置斷裂，同時容易在羰基被還原、羥基被氧化，產生了降解物和與降解相關的物質。

表4 枸杞酒發酵中酚酸變化規律Table 4 Changes of phenolic acid in fermentation of goji wine

續表4

2.4 模擬體系中酚酸的降解產物分析

由表4和表5比較分析，發酵模擬體系與枸杞酒中酚酸單體降解產物種類相同，含量的數據基本吻合，模擬體系中酚酸降解產物有9種，枸杞酒發酵后的酚酸降解產物有8種，兩者有差異的原因可能是枸杞酒發酵前預處理或發酵環境引起的。

表5 模擬體系中酚酸降解產物分析Table 5 Analysis of phenolic acid degradation products in simulated systems

3 結論

本研究對枸杞酒釀造過程中不同預處理條件和發酵過程中酚酸含量及降解產物的變化進行測定，發現酚酸在枸杞酒釀造過程中，因其含有多不飽和雙鍵、酯鍵、羥基基團，不穩定因素非常多，容易發生降解、氧化、還原反應，產生2,5-二甲基吡嗪、苯乙酮、4-乙基愈創木酚、丙酸、苯乙酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚、4-甲氧基苯乙烯和乙酸異戊酯。解析了枸杞中酚酸物質在枸杞發酵前后的變化規律，為進一步探究酚酸降解產物對枸杞酒品質的影響提供了基礎。