即墨黃酒煮糜工藝對揮發性物質的影響

蔣彰，周志磊，姬中偉，韓吉臣，毛健,3*，周哲敏

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)3(國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興，312000)4(山東即墨黃酒廠有限公司，山東 青島，266200)

黃酒是我國獨有的酒種，是世界三大古酒之一，具有悠久的歷史和獨特的釀造工藝。其中，即墨黃酒由于其“微苦焦香”的風味深受廣大消費者的喜愛，享有“黃酒北宗”的美稱，是中國北方黃酒的代表。即墨黃酒采用獨特的古遺六法釀造工藝：“黍米必齊，曲蘗必時，水泉必香，陶器必良，湛熾必潔，火齊必得”，其中“火齊必得”所對應的工藝階段是“煮糜”。“煮糜”是指將浸米后的大黃米倒入鍋中生火加溫，待米煮透后，邊加溫邊用鍋鏟攪拌，使糜焦而不糊,這一步是古法工藝的關鍵步驟，更是即墨黃酒產生焦香的重要途徑[1]。

國內對于黃酒的風味研究已經非常廣泛，但大多還集中于一維氣相色譜技術[2-4]。黃酒的香氣成分組成復雜，同時存在大量的色譜峰共流出的問題，一維氣相色譜靈敏度低，通常只能鑒定幾十個物質，越來越不能滿足復雜樣品基質的分析要求。全二維飛行時間質譜(comprehensive two dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS)將全二維氣相色譜優異的分離能力、高峰容量和飛行時間質譜的高采集頻率、高靈敏度結合，解決了復雜組分難以分離鑒定的問題[5]。近年來GC×GC-TOFMS已經應用于黃酒香氣的研究中，ZHOU等[6]采用液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)和頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)的前處理方法共定性出267種揮發性成分；WANG等[7]采用溶劑輔助風味蒸發(solvent-assisted flavor evaporation，SAFE)、固相萃取(solid phase-extraction，SPE)和HS-SPME的前處理方法共定性出106種物質，并使用標準曲線法對其中47種物質進行定量。

目前，國內對即墨黃酒的煮糜香氣研究較少，僅有少量文獻對即墨黃酒的香氣成分進行了報道[8-9]。本研究首次采用HS-SPME-ARROW和SAFE結合GC×GC-TOFMS技術解析即墨黃酒煮糜前后揮發性成分，這不僅探究了工藝對香氣成分的影響，也對即墨黃酒的品質提升提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

煮糜前后樣品(各取5個平行樣)，山東即墨黃酒廠有限公司；C5～C30正構烷烴、2-辛醇(色譜純)、薄荷醇(色譜純)，Sigma-Aldrich(中國上海)；NaCl、無水硫酸鈉、二氯甲烷(色譜純)，中國國藥上海化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

Pegasus GC-HRT 4D+ 全二維氣相色譜-飛行時間質譜，美國LECO公司；PAL RTC 自動進樣系統及孵化爐和加熱攪拌模塊，瑞士CTC analytics AG 公司；120 μm DVB/CAR /PDMS固相萃取頭(PAL SPME ARROW)，瑞士CTC analytics AG 公司；SAFE裝置，德國Glasblaserei Bahr公司；恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；DF-101KS集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州恒巖儀器有限公司；氮吹儀，上海安譜公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HS-SPME法萃取揮發香氣成分

取粉碎后的樣品25 g于燒杯中，加入50 mL超純水，20 ℃條件下于超聲波清洗器中振蕩30 min[10]；取6 mL萃取液于20 mL頂空瓶中，加入3 g NaCl及10 μL 102.5 mg/L 2-辛醇溶液(內標物)，由PAL RTC系統自動進樣。萃取溫度50 ℃，樣品平衡15 min，吸附30 min，解析時間5 min，不分流進樣。

1.3.2 SAFE法萃取揮發香氣成分

取粉碎后的樣品80 g于錐形瓶中，加入160 mL二氯甲烷后用封口膜封口，于20 ℃搖床中以140 r/min振蕩6 h[11]。加入200 μL 100 mg/L薄荷醇溶液(內標物)與濾液定容至100 mL容量瓶中。將1 000 mL圓底燒瓶作為蒸餾瓶置于40 ℃恒溫水浴鍋中，1 000 mL圓底燒瓶作為收集瓶置于液氮中。保持SAFE的夾層為40 ℃，系統壓力在5×10-3Pa左右時開始滴加樣品。待收集瓶內的二氯甲烷融化后使用無水硫酸鈉干燥、過濾，氮吹至1 mL備用。

1.3.3 GC×GC-TOFMS儀器條件

GC×GC條件：色譜柱：一維色譜柱TR-FFAP(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，二維色譜柱Rxi-17 sil MS(1 m×0.25 mm，0.25 μm)。色譜條件：進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；一維柱箱升溫程序：起始溫度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速率升溫至230 ℃保持7 min。調制器調制時間：4 s，熱脈沖時間1.2 s。二維柱溫箱的溫度全程比一維柱溫箱高5 ℃。以高純氦氣作為載氣，流量為1 mL/min。

TOFMS條件：EI離子源，離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度240 ℃，電離能量70 eV。檢測器電壓為1 400 eV。采集質量數范圍33～400 amu，采集頻率為100 spectrum/s。

此外，采用SAFE前處理方法，調制器調制時間為5 s，分流比為1∶10，進樣量為0.2 μL。樣品皆為2組平行。

1.4 數據分析

數據采集由Pegasus 4D工作站采集，通過Chorm-aTOF軟件對數據進行分析，自動識別信噪比(S/N)>50的色譜峰后進行自動積分解卷積和譜庫比對。篩選相似度≥700的化合物后通過保留指數(由相同條件下C5～C30計算得出)定性[12]。

2 結果與分析

2.1 煮糜后樣品揮發性化合物色譜結果分析

由圖1可知，大量化合物在一維色譜圖共流出，無法進行有效的分離，導致關鍵香氣組分無法鑒定。

a-SPME提取后一維總離子流色譜圖；b-SAFE提取后一維總離子流色譜圖；c-SPME提取后二維總離子流色譜圖；d-SAFE提取后二維總離子流色譜圖圖1 煮糜后樣品經SPME和SAFE提取后一維總離子流色譜圖及二維總離子流色譜圖Fig.1 GC×GC-TOFMS total 1D and 2D ion chromatogram of volatile compounds of millet boiling sample by SPME and SAFE

使用二維色譜分離后，在一維時間上同時出峰的化合物可以在二維色譜上得到分離，從而對復雜組分進行定性分析[13]。2種前處理方法對黃酒中揮發性物質的選擇性存在差異，HS-SPME-ARROW前處理所得的色譜峰主要集中在1 750 s之前，而SAFE前處理譜圖的色譜峰則在集中在1 000 s之后。說明HS-SPME-ARROW方法利于吸附易揮發化合物，而SAFE方法則對較高沸點的化合物有良好的提取能力。

2.2 即墨黃酒煮糜前后揮發性化合物特性分析

使用2種前處理方法結合GC×GC-TOFMS，分別對煮糜前后樣品的揮發性組分進行檢測。通過Pegasus 4D色譜分析工作站對質譜庫檢索，選擇S/N>50的色譜峰，相似度 ≥700的化合物作為初步鑒定的結果，進一步去除含硅的柱流出物、烷烴類等不呈風味的化合物，最后通過對比保留指數分別定性出86和403種化合物(表1)。其中煮糜前樣品的揮發性組分以醇類、醛類、酮類、酯類物質為主，而煮糜后樣品的揮發性組分則主要以含氮化合物、醛類、酮類、呋喃類、吡喃類物質為主。由實驗結果可知，僅有35種物質在2種樣品中同時檢出，說明煮糜工藝產生大量揮發性組分。

表1 煮糜前后樣品通過GC×GC-TOFMS鑒定出的揮發性化合物Table 1 Volatile compounds identified in sample before and after millet boiling by GC×GC-TOFMS

醇類化合物在黃酒中是重要的呈香物質，在煮糜前樣品中檢測到20種，占總量的23.26%。其中1-己醇在所有的化合物中峰面積占比最大，具有植物生青的香氣特征，同時也是白酒釀造谷物中重要的香氣物質之一[14]。1-己醇在煮糜后樣品的峰面積僅次于β-苯乙醇，而β-苯乙醇與峰面積占比第3的2-乙基己醇共同賦予了煮糜后樣品花香的香氣特征。

醛、酮類化合物在煮糜前、煮糜后的樣品中分別檢測到37種83種，分別占總量的43.02%和20.60%。其中苯甲醛、苯乙醛同時在2種樣品的中峰面積分別占比第1、第2，呈現的苦杏仁香氣可賦予即墨黃酒獨特的堅果風味。而具有獨特焦糖風味的甲基環戊烯醇酮[15]僅在煮糜后樣品中檢出，即墨黃酒獨特的煮糜工藝不僅使醛、酮類物質的數量增加，還增強了黃酒焦香的風味[16]。

酯類化合物在黃酒中是含量較為豐富的一類化合物，但在原料樣品中檢測到的物質并不多，大部分是在微生物發酵階段產生[17]。同時在2種樣品中檢出的己酸乙酯、苯乙酸乙酯、丁二酸二乙酯具有的水果香、蜂蜜香，使得原料的香氣更加協調。

呋喃、吡喃類化合物也是黃酒中關鍵的一類香氣化合物。糠醛、麥芽酚、乙基糠基醚同時在2種樣品中檢出，其具有特殊的杏仁、烤甜香。在煮糜后樣品中還檢出了菠蘿酮、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、異麥芽醇、3,5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮，這些焦糖香味化合物的結構特征是環酮分子中含有烯醇化的結構單元，此類化合物可能是引起煮糜后樣品焦糖香氣濃郁的主要原因[18]。

含氮化合物包括惡唑、吡咯、吡啶、吡嗪等，在煮糜后樣品中共定性到77種含氮化合物，占總量的19.11%(表2)。惡唑類物質在醋中常被檢出，2,4,5-三甲基惡唑有較強的苦杏仁香氣，被認為是鎮江香醋中重要的香氣化合物[19]；吡咯類物質在焦香麥芽中被檢出[20]，1-糠基吡咯、2-乙酰基吡咯、2-吡咯甲醛為煮糜樣品帶來了烘烤、咖啡香氣；而在2種樣品中同時檢出的吲哚，在白酒的窖泥中也有檢出，其在不同的濃度下有不同的香氣特征[21]；吡啶類物質中的2-乙酰基吡啶、4-乙酰基吡啶有煙氣、爆米花香。吡嗪類物質是黃酒香氣的重要來源，本次在煮糜樣品中共檢測出37種吡嗪類物質，其中2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、2-乙酰基吡嗪、2-甲基-5-異丙基吡嗪具有可可、咖啡、烘焙、堅果的香氣，而2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪還具有抗氧化的功能性[22]。煮糜工藝中長時間高溫反應發生的美拉德反應可能是導致吡嗪類化合物大量增加的主要原因[23-24]。

表2 煮糜后樣品中鑒定的含氮化合物Table 2 Nitrogen-containing compounds identified in millet boiling sample

續表2

3 結論

本研究采用HS-SPME-ARROW和SAFE的前處理結合GC×GC-TOFMS方法解析即墨黃酒煮糜前后樣品，通過譜庫檢索和保留指數比對分別鑒定出86和403種揮發性化合物，說明經過煮糜工藝產生了大量揮發性風味物質。其中具有焦糖香、烘烤香、堅果香的醛類、酮類、含氮化合物、呋喃類、吡喃類物質的數量增加，對煮糜樣品的焦香風味均有所貢獻。此外萜烯類、酚類、內酯類、含硫化合物的數量也有增加，這些化合物共同形成了煮糜的風格特征。但本研究只是對煮糜前后的樣品進行了分析，煮糜工藝對即墨黃酒的風味貢獻值得進一步探究。