利巴韋林抗酪氨酸酶活性及其在貢梨中的保鮮應用

鄧維良，柴緯明，羅麟霜

(江西師范大學 生命科學學院，功能有機小分子教育部重點實驗室，江西 南昌，330022)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)，又稱為多酚氧化酶，廣泛存在于植物、動物和微生物當中[1-2]。在植物當中，酪氨酸酶可催化酚類物質氧化生成醌類物質，再經過聚合作用形成引起褐變的色素物質[3-4]。在許多食品(如水果、果汁、蔬菜等)中，這一過程直接影響產品的自然外觀和營養價值，進而降低產品的經濟價值。因此，抑制酪氨酸酶活性，可有效減緩酶促褐變的發生，高效安全的酪氨酸酶抑制劑可以維持果蔬品質并延長其貨架期。迄今為止，已有文獻報道了部分酪氨酸酶抑制劑，但不論是天然的還是有機合成的化合物，安全性差、活性低、溶解性差等諸多原因限制了其在食品工業中的應用[5-6]。因此，尋找新型的酪氨酸酶抑制劑仍是當下食品領域的研究熱點。

1,2,4-三唑是含有3個氮原子的五元芳香雜環化合物，其獨特的富電結構使得其衍生物能夠很好地與酶和生物受體相結合，從而表現出廣泛的生物活性。研究表明1,2,4-三唑的衍生物能夠有效地抑制酪氨酸酶活性，并且在芒果的保鮮過程中表現出良好的效果[7-9]。利巴韋林又稱三氮唑核苷，化學名為1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酰胺，具有廣譜的抗病毒活性，可用于治療人的呼吸系統疾病[10]。然而，利巴韋林的抗酪氨酸酶活性及保鮮作用卻從未被研究過。因此，在本研究中使用酶動力學實驗、熒光淬滅實驗、非輻射能量轉移和分子對接等手段，探究利巴韋林對酪氨酸酶的抑制作用和抑制機理。此外，我們還對利巴韋林對貢梨的保鮮效果進行了初步研究。本論文的研究結果可為開發新型的果蔬保鮮劑提供理論依據和實踐基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

蘑菇酪氨酸酶(比酶活力為6 680 U/mg)、L-3,4′-二羥基苯丙氨酸(L-3,4′-dihydroxyphenglalanine,L-DOPA)，美國sigma公司；利巴韋林、人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，上海阿拉丁試劑公司；貢梨,超市；蒸餾水均為去離子重蒸水；其他試劑均為分析純。

UD-730紫外分光光度計，美國Beckman公司；FluoroMax PLUS 熒光光譜儀，日本Horiba公司；VGT—1860Q超聲波清潔儀，寧波新芝公司；NICO超純水機，中國尼珂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 利巴韋林對酪氨酸酶活性的抑制效果分析

以L-DOPA作為底物，研究利巴韋林對酪氨酸酶活性的抑制效果[11-12]。將利巴韋林溶解于DMSO，初始濃度為3 mmol/L，實驗時分別稀釋至0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mmol/L。在3 mL的反應體系中依次加入0.75 mL 0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)、0.3 mL 2 mmol/LL-DOPA、0.1 mL利巴韋林溶液和1.8 mL H2O，最后加入0.2 mg/L酪氨酸酶溶液,混勻后立即在475 nm波長下測定初始反應速率。以動力學曲線的初始斜率來表示酪氨酸酶的活性，按照公式(1)計算酪氨酸酶的相對活性。IC50為酶活性被抑制一半(酶的相對活性為50%)時的抑制劑濃度，IC50越低表明抑制劑對酶的抑制作用越強。

(1)

式中：Us，實驗組(含有不同濃度的利巴韋林)的酶活性；Uc，對照組(不含利巴韋林)的酶活性。

1.2.2 利巴韋林對酪氨酸酶的抑制動力學分析

在以上抑酶效果測定體系中，保持底物L-DOPA的濃度不變，改變酪氨酸酶的加入量。通過酶促反應速率對酪氨酸酶質量濃度作圖來判斷利巴韋林對酪氨酸酶活性的抑制機制。

在同樣的測定體系中維持酪氨酸酶的濃度不變，改變體系中L-DOPA的濃度，測定酶促反應速率。利用Lineweaver-Burk方程進行雙倒數作圖，根據直線交點的位置來判斷利巴韋林對酪氨酸酶活性的抑制類型[13]。用不同直線的斜率對利巴韋林濃度進行二次作圖，可求得利巴韋林對游離酶的抑制常數KI。

1.2.3 熒光淬滅實驗

利巴韋林對酪氨酸酶的熒光淬滅實驗參照CHAI等[14]的方法。采用Stern-Volmer方程[15]對熒光淬滅的數據進行分析,如公式(2)所示:

(2)

式中:F和F0分別是酪氨酸酶在有無利巴韋林存在時的熒光強度；Ksv，Stern-Volmer淬滅常數；Kq，生物分子淬滅速率常數；[c]，利巴韋林的濃度；τ0為熒光分子的平均壽命，約為10-8s。此外，對于靜態淬滅過程，結合位點的數量n和表觀結合常數KA可以通過公式(3)進行計算[16]:

(3)

1.2.4 非輻射能量轉移分析

參照HUANG等[17]的方法，以HSA為標準測量酪氨酸酶的熒光量子產率。利用紫外分光光度計測定利巴韋林(0.4 mol/L)在300～500 nm的紫外吸收光譜，根據利巴韋林的紫外吸收光譜和酪氨酸酶的熒光發射光譜的重疊面積，可計算出利巴韋林與酪氨酸酶作用過程中的能量轉移效率E和結合距離r，按照公式(4)～(6)[18]進行計算：

(4)

R6=8.79×10-25N-4K2Jφ

(5)

(6)

式中：R0，F?rster距離；F和F0分別為有無利巴韋林存在時酪氨酸酶的熒光強度，F(λ)，在波長λ處的熒光強度；N，介質的平均折射率，值為1.336；K2，空間取向因子，值為2/3；ε(λ)是利巴韋林在波長λ處的摩爾吸光系數；φ，酪氨酸酶的熒光量子產率；J，酪氨酸酶的熒光光譜和利巴韋林紫外吸收光譜的重疊積分。

1.2.5 分子對接

從RCSB蛋白數據庫(http://www.rcsb.org/)和Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih gov/)中獲得蘑菇酪氨酸酶(PDB entry 2Y9W)和利巴韋林(CID 37542)的晶體結構。對接前除去酪氨酸酶中的溶劑水分子和銅原子，使用 Autodock 4.2進行分子對接，選擇結合能量最低的構象作為最終結果[14]。

1.2.6 利巴韋林對貢梨的保鮮效果

選擇形狀、顏色、大小和成熟度均相同，無任何損傷的貢梨。將其經去皮處理后，切成形狀和大小相同、厚度5 mm左右的梨塊，在不同濃度的利巴韋林溶液中浸泡10 min后裝入聚乙烯袋中，置于15 ℃、相對濕度為80%的培養箱中貯藏[19]。每天稱量梨塊的質量，并按照公式(7)計算失重率：

(7)

式中：m0為初始梨塊質量，g；ms為每天測量的梨塊質量，g。

參照LIU等[20]的方法，使用貢梨梨汁來研究利巴韋林的抗褐變效果。將貢梨去皮處理后切成質量為10 g的梨塊，用不同濃度的利巴韋林溶液浸泡10 min后研磨成勻漿，4 ℃下8 000 r/min離心5 min，收集上清液3 mL。梨汁置于15 ℃、相對濕度為80%的培養箱中貯藏。用紫外分光光度計每天測量梨汁在420 nm處的吸光度值，每次測量重復3次。

1.2.7 數據統計

所有實驗平行重復3次，實驗數據以平均值±標準差的形式表示。使用Duncan多重比較法檢驗數據之間的差異顯著性(P<0.05)。采用Origin 2017軟件進行數據處理、繪圖和曲線擬合。

2 結果與討論

2.1 利巴韋林對酪氨酸酶的抑制效果

如圖1所示，隨著利巴韋林濃度的增加，酪氨酸酶的相對活性逐漸降低，其導致酪氨酸酶活力下降至一半的濃度(IC50)為(0.3±0.05)mmol/L；當利巴韋林濃度達到0.4 mmol/L時，酶的相對活力下降到26.8%。以上結果說明利巴韋林能夠有效抑制酪氨酸酶的活性,與目前已經報道的酪氨酸酶抑制劑，如阿莫西林[12](IC50= 0.9 mmol/L)、熊果苷[21](IC50= 2.7 mmol/L)相比，利巴韋林是一種相對高效的酪氨酸酶抑制劑。

圖1 利巴韋林對酪氨酸酶的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of ribavirin on tyrosinase

2.2 利巴韋林對酪氨酸酶的抑制機理分析

抑制機理分析的結果表明：在不同濃度利巴韋林存在下，酪氨酸酶活性對酶質量濃度作圖得到一組過坐標原點的直線(圖2)。隨著利巴韋林濃度的增加，直線1～6的斜率逐漸下降，這說明利巴韋林對酪氨酸酶的抑制作用是一個可逆的過程,并沒有降低酪氨酸酶的總量，而僅僅是抑制了酪氨酸酶的催化活性。

圖2 利巴韋林對酪氨酸酶的抑制機制Fig.2 Inhibitory mechanism of ribavirin on tyrosinase注：直線1～6利巴韋林濃度分別為0、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mmol/L

2.3 抑制類型和抑制常數分析

采用Lineweaver-Burk方程來判斷利巴韋林對酪氨酸的抑制類型。以酶促反應速率倒數1/v對底物濃度倒數1/S作圖，其結果如圖3-a所示。隨著利巴韋林濃度的增大，直線斜率逐漸增大，且所有直線均相交于縱軸，這表明利巴韋林是一種競爭型的酪氨酸酶抑制劑，可以與底物L-DOPA競爭酶的活性中心。此外，以直線斜率對利巴韋林濃度進行二次作圖，得到一條具有良好線性關系的直線(圖3-b)，這表明利巴韋林在酪氨酸酶上只有一個或者一類結合位點，通過計算得到抑制常數KI為(0.144±0.02) mmol/L。

a-抑制類型；b-抑制常數圖3 利巴韋林對酪氨酸酶的抑制類型和抑制常數Fig.3 Inhibitory type and inhibition constant of ribavirin on tyrosinase注：直線1～4的利巴韋林濃度分別為0、0.15、0.2、0.3 mmol/L

2.4 熒光淬滅分析

如圖4-a所示，曲線7代表5 μmol/L利巴韋林的熒光發射光譜，曲線1～6對應的利巴韋林濃度分別為0、0.5、1、2、3和5 μmol/L，以及酪氨酸酶的熒光發射光譜。結果表明，隨著利巴韋林濃度的增加，酪氨酸酶的熒光強度顯著下降(P<0.05)，當利巴韋林的濃度為5 μmol/L時，酪氨酸酶熒光發射光譜的峰值降低到59.8%(圖4-b)，這說明利巴韋林可有效淬滅酪氨酸酶的內源熒光。KIM等[22]的研究發現，抑制劑中的羥基是淬滅酶內源熒光的主要基團，進而推測利巴韋林主要通過其呋喃環上的羥基與酪氨酸酶發生作用從而淬滅酶的熒光。此外，隨著利巴韋林濃度的增加，酪氨酸酶發射熒光光譜的峰值發生了明顯的紅移(由325 nm變為335 nm)，這表明利巴韋林可通過與酪氨酸酶的相互作用導致酶構象的改變[23]。

a-酪氨酸酶熒光光譜圖；b-酪氨酸酶相對熒光強度變化圖4 熒光淬滅實驗結果Fig.4 Results of fluorescence quenching experiment注：曲線1～6的利巴韋林濃度分別為0、0.5、1、2、3、5 μmol/L，曲線7為5 μmol/L利巴韋林溶液的熒光光譜

本研究采用Stern-Volmer方程對淬滅結果進行分析，如圖5-a所示,F0/F對利巴韋林濃度[c]作圖得到了一條具有良好線性關系的直線，這表明利巴韋林對酪氨酸酶的淬滅機制只有1種[24]。根據公式(2)可進一步計算出淬滅速率常數Kq的值為1.27×1013L/(mol·s)，這比最大散射碰撞淬滅常數2.0×1010L/(mol·s)高出3個數量級[25]。以上結果表明利巴韋林淬滅酶熒光的機制為靜態淬滅。

對于靜態淬滅，可根據公式(3)計算出表觀結合常數KA和結合位點數n。以lg[(F0-F)/F]對lg[c]作圖，根據所得直線(圖5-b)的斜率和截距，計算得到KA和n分別為(16.29±0.94)×104L/mol和0.92±0.04。其中，結合位點數n約等于1，表明利巴韋林在酪氨酸酶只存在1個結合位點。

a-Stern-Volmer 方程繪圖曲線；b-lg[(F0-F)/F]對lg [c]線性回歸曲線圖5 Stern-Volmer 方程繪圖曲線和lg [(F0-F)/F] 對lg [c]線性回歸曲線Fig.5 Stem-Volmer plot of fluorescence quenching and the plot of lg[(F0-F)/F] against lg [c]

2.5 非輻射能量轉移分析

以HSA為對照，測得酪氨酸酶的熒光量子產率為0.06。酪氨酸酶熒光發射光譜與利巴韋林紫外吸收光譜重疊如圖6所示。通過公式(6)計算出重疊積分J為4.96×10-19(cm3·L)/ mol。根據公式(4)和(5)分別計算出能量轉移效率E等于0.4，結合距離r和臨界距離R0分別為1.15 nm和1.08 nm，其中0.5R0

1-酪氨酸酶熒光光譜；2-利巴韋林吸收光譜圖6 酪氨酸酶熒光光譜和利巴韋林吸收光譜的重疊面積Fig.6 The overlap of fluorescence spectrum of tyrosinase and the absorption spectrum of ribavirin

2.6 分子對接分析

對接結果如圖7所示，圖7-a顯示了利巴韋林和酪氨酸酶活性中心的結合模式，可以看出利巴韋林能夠很好地嵌入到酪氨酸酶的活性口袋。進一步分析了利巴韋林與酪氨酸酶活性口袋處的氨基酸殘基的結合情況，從圖7-b可以看出，利巴韋林呋喃環上所連接的羥基，可與和酪氨酸酶B鏈上Lys379、Glu356、Gln307形成氫鍵，測得間距分別為0.21、0.3、0.22 nm。而連接在1,2,4-三唑雜環上的羧酰胺基，則與B鏈的Asp312、Val313、Asn310形成氫鍵，其間距分別為0.2、0.23和0.23 nm。分子對接的結果表明，利巴韋林可以強有力地結合到酪氨酸酶的活性中心，并與周圍的氨基酸殘基形成氫鍵。

a-酪氨酸酶和利巴韋林對接模型；b-利巴韋林和酪氨酸酶氨基酸殘基形成氫鍵圖7 利巴韋林(藍色)和酪氨酸酶分子對接結果Fig.7 Molecular docking results of ribavirin and tyrosinase

2.7 貢梨保鮮實驗

不同濃度的利巴韋林對貢梨鮮切梨塊和梨汁的保鮮作用如圖8所示，其中曲線1～5的利巴韋林濃度依次為0、0.04、0.2、0.4和0.8 mmol/L。

a-利巴韋林對鮮切梨塊失重率的影響；b-利巴韋林對梨汁褐變度的影響圖8 利巴韋林對貢梨的保鮮效果Fig.8 Effect of ribavirin on the preservation of Gong pear注：曲線1～5的利巴韋林濃度為0、0.04、0.2、0.4、0.8 mmol/L

由圖8可知，隨著貯藏時間的延長，梨塊的失重率和梨汁的褐變度均呈上升趨勢。但隨著利巴韋林濃度的增加，相較于空白對照組，梨塊的失重率和梨汁的褐變程度均顯著下降(P<0.05)，當利巴韋林濃度為0.8 mmol/L時，梨塊的失重率減小至對照組的44.8%。由此可知，利巴韋林在貢梨保鮮過程中能夠顯著降低失重率和減少褐變產物的生成。LIN等[19]的研究發現，奧美拉唑可有效抑制鮮切蘋果中的多酚氧化酶活性，從而抑制褐變的發生。由此，可推測利巴韋林可抑制貢梨當中的多酚氧化酶活性，從而減緩貢梨當中酚類物質的氧化。

3 結論

利巴韋林是一種高效的酪氨酸酶抑制劑，其IC50為(0.3±0.05)mmol/L，且利巴韋林抑制酪氨酸酶屬于可逆、競爭性抑制。利巴韋林可與酪氨酸酶通過1個結合位點形成“利巴韋林-酶”靜態復合物，從而淬滅酪氨酸酶的內源熒光，這一過程伴隨著非輻射能量轉移和酶構象的改變。利巴韋林可嵌入到酪氨酸酶的活性口袋并與周圍的6個氨基酸殘基形成氫鍵。利巴韋林對于貢梨具有很好的保鮮效果，能夠有效地降低鮮切梨塊的失重率和梨汁的褐變程度。本論文的研究結果為開發新型的果蔬保鮮劑提供了理論依據和實踐基礎。