UPLC-MS/MS法快速測定乳酸菌發酵食品中的苯乳酸

寧亞維，侯琳琳，于同月，劉茁，楊正，王志新，賈英民

1(河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊，050018)2(北京工商大學 食品與健康學院，北京，100048)

苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是一種安全無毒、對酸和熱穩定、溶解性良好，能夠在食品體系中均勻擴散的多功能性天然有機酸[1]。苯乳酸具有廣譜抑菌作用，可有效抑制革蘭氏陽性菌(如Staphylococcusaureus、Listeriamonocytogenes、Bacillussubtilis等)、革蘭氏陰性菌(如Escherichiacoli、Salmonellaenterica、Pseudomonasaeruginosa等)和真菌(如Colletotrichumgloeosporioides、Aspergillusflavus、Aspergillusniger、Botrytiscinerea等)[2-4]。此外，苯乳酸還可以發揮抑制體外血小板聚集[5]、擴張冠狀動脈[6]、治療心肌梗死[7]以及激活免疫[8]等生理作用。因此,苯乳酸在食品防腐以及醫藥行業中具有廣泛的應用前景。

苯乳酸可以通過微生物發酵產生[9]，已報道能夠產生苯乳酸的微生物主要有植物乳桿菌、希氏乳桿菌、明串珠菌屬[10-11]、凝結芽孢桿菌、乳酸片球菌和戊糖片球菌[12-13]等乳酸菌，相關的含苯乳酸的食品有酸面團[14-15]、竹茶酒[16]、酸奶[17]、泡菜[7]、食醋[18]等乳酸菌發酵食品。我國傳統發酵食品種類豐富，除泡菜、酸奶等食品外，發酵豆制品、發酵面制品(饅頭、面包等)、特色發酵酒類等發酵過程均有乳酸菌的參與，因此有必要建立乳酸菌發酵食品中苯乳酸的檢測方法，以全面分析苯乳酸在乳酸菌發酵食品中的分布情況，為菌株資源的挖掘提供科學依據。目前,食品中苯乳酸的檢測主要有GC-MS、HPLC、LC-MS、2D-HPLC等方法，GC-MS法可以提高樣品中苯乳酸的分辨率，但樣品需要進行酯化和萃取等繁瑣復雜的前處理[19-21]；HPLC法分辨率與靈敏度較低，最低檢出限為1.67 mg/L，對于一些苯乳酸含量較低的樣品不能檢出，且單個樣品至少需要25 min，分析時間較長[17]；LC-MS技術克服了選擇性低的缺點，最低檢出限可達0.16 mg/L，但單個樣品檢測需要25～30 min，相對耗時較長[14,18]；而2D-HPLC對設備要求高，程序復雜不宜實施，單個樣品檢測時間20 min，其間還需控制色譜閥的切換[22]。因此，上述技術在復雜食品體系中苯乳酸定量分析方面均存在一定局限性，如何高效地測定食品體系中苯乳酸的含量有待進一步研究。超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)能在短時間內實現良好的分離效果，MS/MS中的多反應監測(multi-reaction monitoring，MRM)模式可以顯著提高信噪比。UPLC-MS/MS兼具UPLC對復雜樣品分離能力高效、分析檢測時間短，以及質譜MS靈敏度高和特異性強等優點，可以作為發酵食品中苯乳酸定量分析的有效工具。

因此，為了快速而準確地分析發酵食品中苯乳酸的含量，本文建立了苯乳酸的UPLC-MS/MS檢測方法，并用此方法對16種市售乳酸菌飲料、8種發酵乳、11種黃酒樣品、發酵豆制品、米酒、奶酪、發酵香腸、饅頭、面包等食品中苯乳酸的含量進行測定，以期擴大篩選高產苯乳酸菌株的原料范圍，以及為發酵食品中優良菌株資源挖掘提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

AB SCIEX QTRAP 6500質譜儀，美國AB公司；UPLC-20島津超高效液相色譜儀，日本島津公司；3-18 K冷凍離心機，德國Sigma公司；LABDANCER S25旋渦混合器，廣州儀科實驗室技術有限公司；恒溫搖床，上海智城分析儀器制造公司；JJ1000電子分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 試劑和樣品

標準品：D-苯乳酸，純度98%(色譜純)，美國Sigma公司；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純)，德國Merck公司；發酵食品均隨機采購于石家莊多家大型超市。

1.3 實驗方法

1.3.1 苯乳酸檢測方法的建立

1.3.1.1 流動相與洗脫條件的選擇

采用等度和梯度2種洗脫方式對苯乳酸進行分析，先后選用乙腈(A)和水(B)、0.1%甲酸-乙腈溶液(A)和0.1%甲酸-水溶液(B)、0.3%甲酸-乙腈溶液(A)和0.3%甲酸-水溶液(B)做為流動相。綜合考慮分析時間、峰形對稱度和離子豐度等因素，最終確定流動相及洗脫條件。

1.3.1.2 質譜條件的選擇

質譜通過對目標化合物苯乳酸母離子、碎片子離子的識別實現對物質的定性和定量，采用電噴霧離子源進行離子化，考慮到苯乳酸是有機酸，分子量為166.17，離子模式選用了負離子模式。在全掃描模式下，確定[M-H]-作為PLA的母離子。子離子掃描時，選定2個豐度高并且穩定的子離子，在MRM模式下優化裂解電壓和碰撞能。

1.3.1.3 苯乳酸標準曲線的繪制及檢出限的測定

配制質量濃度為1 000 ng/mL的苯乳酸標準儲備液，梯度稀釋得到苯乳酸的濃度系列：1、10、50、100、200、300、500 ng/mL。在確定的色譜條件下進樣1 μL，以峰面積的積分值為縱坐標，苯乳酸質量濃度(ng/mL)為橫坐標，繪制標準曲線。取低質量濃度苯乳酸的標準溶液，用超純水逐級稀釋并測定，根據S/N=3和S/N=10確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.3.1.4 樣品的前處理

稱取10 g(精確到0.01 g)樣品于20 mL容量瓶中(固態食品經研磨至均勻細粉后稱取)，加去離子水定容。然后向上述混合液中再加入3 mL甲醇，240 r/min條件下振蕩10 min，10 000 r/min離心10 min。最后取上清液過0.22 μm膜稀釋到線性范圍內待測。

1.3.1.5 精密度及穩定性實驗

分別將1.4、2.8、4.2 mg/kg添加水平的苯乳酸標準樣品添加到含有苯乳酸的發酵乳樣品[苯乳酸含量(2.8±0.14)mg/kg]中，按照1.3.1.4小節進行樣品前處理，每個濃度做3個平行，每個樣品平行進樣5次分析，計算平均回收率和相對標準偏差。同一個樣品于一天內5個不同時段進樣分析，連續3 d進行測定，取平均值并計算RSD值。

1.3.2 實際樣品的測定

用已建立的UPLC-MS/MS檢測法對采集于石家莊各超市的8種活菌型乳酸菌飲料、8種滅菌型乳酸菌飲料、8種發酵乳、11種黃酒、發酵豆制品、米酒、奶酪、發酵香腸、饅頭、面包等食品中的苯乳酸進行測定。

1.4 數據處理

每個樣品做3個獨立平行，利用SPSS 19.0軟件通過單因素方差分析法(P<0.05)對數據進行統計分析，并通過Origin Pro 8軟件對實驗結果進行作圖。

2 結果與分析

2.1 苯乳酸檢測方法的建立

2.1.1 流動相的選擇

采用配備雙泵和自動進樣器的日本島津高效液相色譜儀(UPLC-20)進行色譜分析，使用Shim-pack XR-ODS C18(3.0 mm×75 mm，2.2 μm)色譜柱。通過對等度與梯度洗脫程序及甲酸添加量的探索，確定洗脫條件為梯度洗脫:0～1 min，10%B；1～4 min，10%～90%B；4～6 min，90%B；6～6.1 min，90%～10%B；6.1～9 min，10% B，進樣量：1 μL。對不同的柱溫和流速進行探索后，確定最終條件為流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃。在此條件下，苯乳酸具有較好的分離效果，在5 min內出峰，且峰型良好。

2.1.2 質譜條件的選擇

采用配有電噴霧電離源(ESI)的AB SCIEX QTRAP 6500三重四極桿-線性離子阱復合質譜儀進行分析，在全掃描模式下，確定[M-H]-作為苯乳酸的母離子。采用儀器的自動調諧功能，將響應強度最大的子離子設定為定量離子，響應強度較弱的子離子設定為定性離子，確定碰撞能質荷比(m/z)146.9和118.8分別為苯乳酸的定量子離子和定性子離子，在MRM模式下優化裂解電壓均為-80 V，碰撞電壓分別為-16 V和-23 V。最終確定質譜條件，離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：負離子模式；多反應監測(MRM)；霧化氣：氮氣；霧化溫度：500 ℃；霧化氣壓力：70 psi；輔助氣壓力：60 psi；氣簾器：35 psi；噴霧電壓：-4 500 V。由10 ng/mL標準樣品的LC-MS色譜圖(圖1)和提取離子流量色譜圖(圖2)的檢測結果可知，苯乳酸的出峰時間為3.11 min，目標峰峰型良好，說明優化的質譜條件適用于苯乳酸的檢測。

圖1 標準品LC-MS色譜圖Fig.1 LC-MS chromatogram of standard

圖2 標準品提取離子流量色譜圖Fig.2 Chromatogram of extract ion flow rate of standard substance

2.1.3 線性范圍、檢出限、定量限的確定

對1、10、50、100、200、300和500 ng/mL的苯乳酸標準溶液進行定量分析，以標準品質量濃度為X軸，以峰面積的積分值為Y軸，計算回歸方程和相關系數。標準曲線Y=15 014X-9 784.1，相關系數R2為0.999 9，說明苯乳酸在1～500 ng/mL范圍內線性關系良好。依據定量離子色譜峰的信噪比確定該方法下苯乳酸的檢出限和定量限分別為0.3和1 ng/mL，顯著低于2D-HPLC方法的檢出限(0.16 μg/mL)和定量限(0.52 μg/mL)[22]，表明該方法具有較高靈敏度，能夠滿足食品中苯乳酸的檢測需要。

2.1.4 方法精密度測定

通過添加3個水平的苯乳酸標準樣品到發酵乳中，每個添加濃度重復5次，測定回收率量化該方法的精密度。根據 GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》中回收率的相關規定，被測組分含量1～100 mg/kg時，回收率范圍在90%～110%內實驗結果可信。結果如表1所示，苯乳酸的平均回收率為90.5%～105.0%，日內相對標準偏差范圍(RSDr)為1.2%～1.9%，日間相對標準偏差范圍(RSDR)為1.3%～4.4%，說明該方法具有良好的精密度、重現性和穩定性，符合檢測要求。發酵乳制品的UPLC-MS色譜圖和提取離子流圖分別見圖3和圖4，苯乳酸的出峰時間為3.11 min，峰型良好且附近沒有雜質干擾，單個樣品測定僅需要9 min，回收率測定結果具有較高的準確性和重復性。

表1 苯乳酸加標回收率Table 1 Standard recovery of PLA

圖3 發酵乳制品的UPLC-MS色譜圖Fig.3 UPLC-MS chromatogram of fermented dairy products

圖4 發酵乳制品的提取離子流量圖Fig.4 Extract ionic flow of fermented dairy products

與GC-MS[19]測定蜂蜜中苯乳酸的方法相比，預處理簡單；與LC-MS/MS[18]測定食醋中苯乳酸的方法相比，靈敏度高，且節省時間和有機溶劑。因此，該方法預處理簡單、分析時間短、靈敏度高、準確性和重現性良好，可有效應用于發酵乳制品中苯乳酸的檢測。

2.2 發酵食品中苯乳酸含量的分析

2.2.1 發酵乳及乳飲料中苯乳酸含量的分析

發酵乳通常是以羊乳或者牛乳等為發酵原料，通過乳酸菌發酵而成。推測發酵乳和乳酸菌飲料中可能含有乳酸菌代謝產物苯乳酸。因此，本研究采用已建立的UPLC-MS/MS法對8種市售活菌型乳酸菌飲料、8種滅菌型乳酸菌飲料和8種發酵乳制品中苯乳酸進行了測定，結果如表2所示：75%的樣品苯乳酸含量低于4 mg/L，僅有3種樣品苯乳酸含量高于18 mg/L。部分樣品苯乳酸的含量為0.03～0.32 mg/L，低于高效液相色譜對苯乳酸的檢出限，不能用高效液相色譜法檢出。其中發酵乳中苯乳酸的含量明顯高于乳酸菌飲料，而所測大部分乳酸菌飲料和發酵乳中苯乳酸含量較乳酸菌在乳酸菌MRS培養基中的產量低[10]。分析原因可能有2方面：發酵乳發酵時間通常較短，多數在4～6 h之間，尚未達到乳酸菌產苯乳酸高峰期；另外，盡管有些乳酸菌飲料在制備時發酵時間較長可以達到72 h，但乳酸菌飲料在制備過程中需要加入水及多種物質進行稀釋和調味，因此苯乳酸濃度被高度稀釋。苯乳酸具有廣譜抑菌性，YU等[17]將高產苯乳酸的菌株PediococcuspentosaceusSK25應用于發酵酸乳的研究，為產苯乳酸的乳酸菌作為酸奶發酵劑用于制作具有長保藏期的酸奶提供了科學依據。而發酵乳中苯乳酸含量的檢測可為酸乳的品質控制提供技術支持。

表2 市售乳酸菌飲料和發酵乳中苯乳酸含量Table 2 Content of PLA in commercial lactic acid bacteria beverages and fermented milk

2.2.2 黃酒中苯乳酸的含量

黃酒是我國自古以來著名的傳統糧食發酵酒，以富含氨基酸的糯米、黍米等糧食為原料，經過酒曲復式發酵方法釀造而成，且酒曲中除了酵母菌外還有乳酸菌參與風味的形成[23-25]，由此推測黃酒中可能存在苯乳酸。采集了11種以糯米為原料的不同品牌黃酒，通過建立的UPLC-MS/MS方法，分析了黃酒中苯乳酸含量。結果由表3所示，可知11種黃酒樣品中的8種樣品中苯乳酸含量大于20 mg/L。包裝標注陳釀時間對黃酒中苯乳酸含量的影響見圖5，樣品1和樣品4、樣品2和樣品7之間均存在顯著性差異(P<0.05)，同種黃酒相比，包裝上標注陳釀時間長的黃酒中苯乳酸的含量相對較低，5年陳的黃酒相對于3年陳的黃酒苯乳酸含量分別降低21.37%和33.81%。此外，有報道稱苯乳酸是復合型保健黃酒竹茶酒的香氣成分[16]，主發酵后苯乳酸的相對含量為2.61%，陳釀后苯乳酸含量相對降低了1.8%，推測在陳釀過程中有機酸可能促進酯化反應，增加黃酒風味的酯香，從而使苯乳酸含量降低。但存在所測樣品量少、批次不同等問題，后續將深入研究黃酒原料及發酵過程對苯乳酸含量的影響。

表3 黃酒中苯乳酸含量Table 3 PLA content in Chinese rice wine

圖5 陳釀時間對黃酒中苯乳酸的影響Fig.5 Influence of aging time on PLA content in Chinese rice wine注：***，P≤0.001；**，0.001

2.2.3 其他乳酸菌發酵食品中苯乳酸的含量

本課題組前期已經證實泡菜、食醋等食品中含有苯乳酸[7]，然而其他乳酸菌發酵食品中是否廣泛存在苯乳酸，目前尚未有研究報道。因此，本研究通過建立的UPLC-MS/MS方法測定了發酵豆制品、米酒、奶酪、發酵香腸、饅頭、面包等食品中苯乳酸的含量。結果如表4所示，所用發酵食品中均有苯乳酸的檢出，其中發酵豆制品的苯乳酸含量相對較高，腐乳中苯乳酸含量最高(22.79 mg/kg)。推測原因為豆制品中富含苯丙氨酸，而乳酸菌可以利用苯丙氨酸代謝途徑產生苯乳酸[26]，因此發酵豆制品中苯乳酸含量較高，而發酵面制品中氨基酸含量低，且目前饅頭、面包等發酵面制品生產中所用的微生物菌株以酵母菌為主，乳酸菌含量較少，因此苯乳酸含量相應也較低[27]，如面包中苯乳酸含量最低(0.42 mg/kg)。該研究結果與已報道的采用酸面團生產的發酵面制品苯乳酸含量存在較大差異，如VAN等[14]研究顯示酸面團中苯乳酸的含量最高可達33.47 mg/kg。由于苯乳酸具有抑菌、提高免疫等多種功能特性[28-29]，因此建議發酵面制品中考慮回歸傳統的酸面團制作方式，即面制品制作中除添加酵母菌發酵外，增加功能性乳酸菌以提高發酵面制品的功能特性。此外，上述檢測結果顯示苯乳酸普遍存在于乳酸菌發酵食品中，可為發酵食品中優良乳酸菌資源的挖掘提供理論參考。

表4 其他乳酸菌發酵食品中苯乳酸含量Table 4 Contents of PLA in other lactic acid bacteria fermented foods

3 結論

建立UPLC-MS/MS方法對乳酸菌發酵食品中苯乳酸的含量進行測定，樣品僅需有機溶劑預處理，操作簡單，檢測時間短，靈敏度高，準確性和重復性好，可用于基質復雜食品中苯乳酸的檢測，并首次在黃酒、發酵豆制品和發酵面制品中檢測到苯乳酸。用此方法測定出24種市售乳酸菌飲料和發酵乳中均含有苯乳酸，其中發酵乳中苯乳酸的含量顯著高于滅菌型乳酸菌飲料；所檢測的11種黃酒中，72.7%的樣品苯乳酸含量大于20 mg/L，批次、陳釀時間可能對黃酒中苯乳酸含量產生影響；發酵豆制品、米酒、奶酪、發酵香腸、饅頭、面包等發酵食品中均有苯乳酸的檢出，說明苯乳酸可能普遍存在于乳酸菌發酵食品中。本研究擴大了篩選高產苯乳酸菌株的原料范圍，為發酵食品中優良菌株的選育提供理論支撐，也為發酵食品的品質與營養功能進一步研究提供科學依據。