白酒中特征手性物質的SLE-GC-MS識別方法

王明，王逍，陳嘉杰，吳奕萱，柯潤輝

(中國食品發酵工業研究院有限公司，國家食品質量監督檢驗中心，北京，100015)

含有不對稱碳原子的分子被認為是手性分子，其手性中心能以2種旋光異構體形式(D-型、L-型或S-型、R-型)存在，稱之為對映體。手性是自然界的重要屬性之一，在生物體中手性分子的2個對映體是以不同的量存在的[1]。近年來，食品領域對識別手性對映體的需求不斷增加，特別是香精香料[2]和葡萄酒[3]。手性對映體的研究可以用于質量控制,檢測“天然”樣品的摻假,確定產品基質的地理來源[4]。純糧白酒的釀造屬于自然發酵，也有手性分子的存在[5-6]，但國內外關于白酒中手性物質的研究較少。乳酸乙酯是白酒的四大酯類之一，因其分子中含有不對稱碳原子，存在2種對映體(D-型和L-型)，對其進行研究具有重要意義[5]。2,3-丁二醇屬于天然發酵產物，是白酒中呈甜味物質[7]，同時起著緩沖平衡的作用，可改善白酒的口感風味[8]。2,3-丁二醇有3種旋光異構體，即S-(+)-2,3-丁二醇、R-(-)-2,3-丁二醇、meso-(R,S)-丁二醇(內消旋體)，其在葡萄酒中主要以R-型和內消旋存在[9-10]，尚未見有關白酒中2,3-丁二醇對映體的研究報道。

要研究白酒中的手性物質，首先要對手性對映體進行拆分，因此選擇合適的手性分離方法至關重要。手性環糊精色譜柱的出現對氣相色譜分析對映體具有重要作用[11]，因其具備廣泛的對映選擇性和分離不同揮發物對映體的能力，適用于手性對映體的分離。本文采用一款新型環糊精手性色譜柱，可分離多種手性對映體且穩定性好，但考慮到白酒中過多的水會降低該手性柱的柱效，因此不可對白酒直接進樣分析。在白酒風味分析中常用的前處理方法主要有液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)、固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)等[12-13]。LLE操作雖簡單，但其萃取溶劑易與水相發生乳化現象，導致分析結果的精密度較低[14]。SPME方法簡便、快速且不需萃取溶劑，但精密度和準確度較低[15]。固相支撐-液液萃取(solid supported-liquid-liquid extraction,SLE)是臨床生物分析實驗室中經常使用的一種高效樣品前處理工具[16]，既可以排除樣品中水的干擾，又能保證方法的精密度和結果的準確性，可用于葡萄酒[14]、醬油[17]等液體樣品的前處理。

本文采用SLE前處理技術對白酒樣品進行萃取，結合手性環糊精色譜柱以實現GC-MS分離和定量白酒中乳酸乙酯和2,3-丁二醇的對映體的目的，為研究手性對映體的含量及比例與白酒風味品質、來源的關系建立快速分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒樣品：茅臺王子酒(53%vol，375 mL)、飛天茅臺(53%vol，500 mL)、水晶劍南春(52%vol，500 mL)、瀘州老窖特曲(52%vol，500 mL)、山西杏花村汾酒(42%vol，475 mL)、紅星二鍋頭8年陳釀(43%vol，500 mL)，市售。

試劑：D-乳酸乙酯(純度>95%)、L-乳酸乙酯(色譜純，純度≥98%)、S-2,3-丁二醇(色譜純，純度≥97%)、R-2,3-丁二醇(純度>97%)、meso-2,3-丁二醇(色譜純，純度≥99%)、乙酸丁酯(色譜純，純度≥99.8%)、仲辛醇(色譜純，純度≥99.5%)、Celite 545 coarse硅藻土，上海安譜實驗科技股份有限公司；二氯甲烷(分析純)、無水乙醇(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、NaCl(分析純),北京化工試劑廠。

1.2 儀器設備

GC-MS-QP2010 Plus氣相色譜-質譜聯用儀(AOC5000 自動進樣器)，日本島津公司；Milli-QReference 超純水系統，美國Millipore公司；RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SE812氮吹儀，北京帥恩科技。

1.3 樣品預處理方法

1.3.1 液液萃取(LLE)

量取10.0 mL酒樣并將酒精度稀釋至10%，加NaCl至飽和，用重蒸二氯甲烷萃取3次，每次10.0 mL，合并萃取相。30 ℃旋轉蒸發并氮吹濃縮，無水硫酸鈉除去洗脫液中的水分，取1.0 μL進GC-MS分析[18]。

1.3.2 固相支撐-液液萃取(SLE)

在20.0 mL的萃取柱中填入9.0 g硅藻土，量取10.0 mL酒樣于柱中，靜置10 min，待樣品和硅藻土全部混合，用30.0 mL二氯甲烷進行洗脫，洗脫液用蒸餾燒瓶進行收集。洗脫液收集完畢，30 ℃旋轉蒸發并氮吹濃縮，無水硫酸鈉除去洗脫液中的水分，取1.0 μL進GC-MS分析[19]。

1.4 GC-MS條件

1.4.1 GC條件

所用色譜柱為手性柱Rt-bDEXse(30 m×0.25 mm,0.25 μm)，柱溫采用程序升溫：初溫60 ℃，保持10 min 后，以4 ℃/min升至100 ℃，再以10 ℃/min升至200 ℃，保持10 min。進樣口溫度220 ℃，分流比50∶1。

1.4.2 MS條件

MS電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度220 ℃，質譜掃描范圍m/z35～350。溶劑延遲5 min，檢測方式：選擇離子檢測SIM。各物質分別設定3個特征離子，乳酸乙酯(m/z45定量，m/z43、75定性)、2,3-丁二醇(m/z45定量，m/z75、90定性)、乙酸丁酯(m/z56定量，m/z61、73定性)、仲辛醇(m/z45定量，m/z55、97定性)。

1.5 定性分析

標準加入法和質譜法：在白酒中分別加入乳酸乙酯、2,3-丁二醇的旋光異構體的標準品，比較標準品加入前后色譜圖上各峰的保留時間以確定目標物的質譜峰，然后篩選出特征離子進行質譜定性。

1.6 定量分析

取一定量的待測物的標準品，用無水乙醇配制成高質量濃度單標后，制成混標，再用無水乙醇將混合后的標準溶液稀釋成多個梯度備用。內標法需要選擇合適的物質作為內標物，將其定量地加入到樣品中作為待測組分的參比物，以目標標準物質的質量濃度與對應內標物質質量濃度之比為橫坐標，以目標標準物質的峰面積與內標物質峰面積之比為縱坐標建立標準曲線，以回歸方程計算樣品中各味物質的含量。

采用 SIM 模式定量。分別以5種旋光異構體的標準品與內標物的質量濃度比和峰面積比建立標準曲線。仲辛醇、乳酸丁酯為內標物，其在酒樣、系列標準溶液中含量均恒定。定量化合物通過標準曲線進行計算。上述均進行3次平行實驗。

1.7 方法驗證

方法檢驗參數為：線性、檢出限(LOD)、精密度。標準曲線線性以線性相關系數(R2)進行評估；檢出限為定量化合物色譜峰信噪比(S/N)大于3對應的質量濃度。每個樣品連續進樣3次，以相對標準偏差(RSD)評估精密度。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 柱溫的選擇

根據萃取溶劑和目標物質的沸點，考察升溫速率為2 ℃/min、3 ℃/min、4 ℃/min、5 ℃/min，初溫為40、50、60和70 ℃和初溫保留時間5、8、10和15 min等條件的分離效果。確定最佳升溫程序為初始溫度60 ℃，保持10 min，以4 ℃/min的速率升至100 ℃，保持5 min，而后以20 ℃/min升至200 ℃，保持5 min。

2.1.2 流速的選擇

比較了0.7、0.9、1.0、1.2 mL/min的分離效果，發現流速大于1.0 mL/min時的分離效果略差，因此選擇1.0 mL/min的流速。在上述優化條件下，各物質標準品的總離子流色譜圖如圖1所示。

1-乙酸丁酯(內標);2-D-乳酸乙酯;3-L-乳酸乙酯;4-S-2-3-丁二醇;5-R-2-3-丁二醇;7-meso-2,3-丁二醇;9-仲辛醇(內標)圖1 混合標準品的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of mixed standard

2.1.3 分流比的選擇

考慮到白酒中乳酸乙酯的含量較高，在樣品分析中選擇分流比50∶1。如圖2所示，在SIM模式下各物質在白酒中的提取離子流圖。

2.2 前處理方法的比較

SLE是將具有高效、高選擇性和吸附性的硅藻土和待測樣品混合均勻，置入萃取小柱中，然后用萃取溶劑以一定的速率進行洗脫目標檢測物的方法[14]。該技術充分發揮硅藻土多孔性、大比表面、低表面活性等特點，實現微觀液液萃取，與傳統LLE應用領域相似，適合由生物體液內萃取非極性和中等極性目標物，可極大地去除內源性干擾物質，并可實現高通量樣品操作[16]。LLE、SLE同時萃取等量的同種酒樣，進行GC分析，結果如表1所示。

圖2 白酒中手性目標的提取離子流色譜圖Fig.2 Ion flow chromatogram of chiral targets in Chinese Baijiu

表1 LLE、SLE萃取效果比較Table 1 Comparison of extraction effects between LLE and SLE

用目標物質出峰面積對比2種方法的萃取效果，結果發現SLE比LLE萃出的峰面積更大，可以萃取出S-2,3-丁二醇，而且操作更方便簡單。

2.3 二氯甲烷用量對萃取效果的影響

選擇二氯甲烷為萃取溶劑，對等量目標物質萃取后進行GC-MS分析，考察二氯甲烷用量為15～50 mL時對目標物質萃取效果的影響，結果如圖3所示。隨著二氯甲烷用量增加，各目標物質的峰面積逐漸上升，這是因為隨著二氯甲烷用量的增加，硅藻土混合物中更多的目標物質被二氯甲烷萃取出來。但當溶劑用量達30 mL以后，各目標物質的峰面積基本穩定，說明達到飽和狀態。因此，為滿足最大的萃取效果以及最大程度地節省試劑，理應選擇30 mL作為萃取用量。

圖3 二氯甲烷用量對目標物質的萃取效果的影響Fig.3 Effect of dichloromethane dosage on the extraction effect of target substances

2.4 SLE-GC-MS方法的線性范圍

依據1.6小節操作法對系列標準溶液中目標物質進行萃取，并進行GC-MS分析， 以目標標準物質的質量濃度與對應內標物質質量濃度之比為橫坐標，以目標標準物質的峰面積與內標物質峰面積之比為縱坐標建立標準曲線繪制各目標物質的標準曲線，結果如圖4所示。

圖4 乳酸乙酯、2,3-丁二醇對映體的標準曲線Fig.4 Standard curve of enantiomers of ethyl lactate and 2,3-butanediol

由表2和圖4可知，SLE法定量白酒中D/L-乳酸乙酯得線性范圍100～1 500 mg/L、S-2,3-丁二醇的線性范圍1～10 mg/L、R-2,3-丁二醇的線性范圍10～100 mg/L、meso-2,3-丁二醇的線性范圍0.5～60 mg/L，5種旋光異構體標準曲線在各自線性范圍內的線性相關系數R2均大于0.99，表明線性關系良好。按大于3倍信噪比計算方法的檢出限，D-、L-乳酸乙酯和S-、R-、meso-2,3-丁二醇的檢出限分別是64.32、47.74、62.70、59.08和26.58 μg/L。

表2 方法檢驗的參數Table 2 Parameters of method validation

2.5 方法的準確度與精密度

在白酒樣品中進行加標回收實驗，在優化條件下每個濃度重復測定3次，根據標準曲線計算濃度，取平均值，獲得5 種光學異構體的平均回收率及相對標準偏差(見表3)。結果表明該方法靈敏度較高，樣品加標回收率均80%以上；方法重現性較好，相對標準偏差1.34%～8.50%。

2.6 SLE-GC-MS對實際樣品的測定

應用所建立的SLE-GC-MS方法檢測白酒樣品中手性對映體的含量，所選酒樣包括醬香型(茅臺王子酒和飛天茅臺)、濃香型(水晶劍南春和瀘州老窖特曲)、清香型(紅星八年陳釀和山西杏花村汾酒)等6種市售白酒，結果見表4和表5所示。6種白酒中均能檢測出乳酸乙酯(D-型、L-型)和2,3-丁二醇(S-型、R-型、meso-型)，其中S-2,3-丁二醇(右旋體)在白酒中首次被發現，說明該方法能夠用于不同類型白酒中對映體含量的檢測。

表3 五種對映體的加標回收率及精密度Table 3 Recovery and relative standard deviation of five optically active isomers

RSD表示標準偏差

趙國宏等[20]建立了自動旋光儀鑒別乳酸乙酯旋光構型的方法，并對白酒中乳酸乙酯對映體及含量進行了研究，認為醬、濃、清三大香型白酒中左旋L大于右旋。但旋光的測定可能受到許多因素如文獻值、溫度、樣品濃度、溶劑及樣品純度的影響，而本實驗利用D-乳酸乙酯和L-乳酸乙酯的標準品，通過GC-MS對酒樣中目標物質進行準確定性。從表4可以看出，實際樣品中D-乳酸乙酯占乳酸乙酯總含量的54.1%～82.5%，高于L-型的含量，表明這3種香型白酒中乳酸乙酯主要以D-型存在。而且6種酒的乳酸乙酯對映體的比例均不同，飛天茅臺的D-乳酸乙酯占比最高，是L-型的4.7倍，杏花村汾酒的D-乳酸乙酯占比最低，是L-型的1.2倍。此外，這3種香型的乳酸乙酯的D/L比例范圍也不一樣，醬香型的2種酒D/L范圍在2.4～4.7，濃香型的2種酒D/L比例范圍在2.2～2.7，清香型的2種酒D/L比例范圍在1.2～2。

表4 三大香型中乳酸乙酯的對映體含量及比例Table 4 The enantiomeric content and proportion of ethyl lactate in the three flavor types

從表5可以看出，6種白酒中2,3-丁二醇主要以R-型和meso-型存在，濃香型的瀘州老窖特曲和水晶劍南春R/meso比例最高(2.5～3)，清香型的杏花村汾酒和紅星八年陳釀中R/meso比例最小(0.91～0.98)，通過方差分析表明3種香型之間的R/meso比例存在差異(P<0.05)。比較6種酒的R/S比例，濃香型的2種酒R/S比例最大(63.1～75.8)，醬香型的2種白酒R/S比例最小(3.6～5.3)，通過方差分析顯示3種香型之間的R/S比例也存在差異(P<0.05)。

表5 三大香型中2,3-丁二醇的對映體含量及比例Table 5 The enantiomeric content and proportion of 2,3-butanediol among the three flavor types

3 結論

本研究建立了SLE提取凈化、手性色譜柱分離，結合GC-MS檢測白酒中乳酸乙酯2種對映體、2,3-丁二醇3種對映體含量的新方法，該方法測得的各物質的標準曲線在所選質量濃度范圍內線性相關系數均大于0.99，且平均回收率在80%以上、RSD在1.34%～8.50%，均能滿足檢測要求。利用該方法對三大香型6款市售白酒中乳酸乙酯、2,3-丁二醇的手性對映體進行了檢測，發現在所檢測的不同白酒中其含量及對映體分布具有差異，并首次在白酒中發現到S-2,3-丁二醇。國外已有成功利用葡萄酒中單萜烯類對映體比例區分不同品種的風格的報道[21]，同理乳酸乙酯、2,3-丁二醇作為白酒中重要的風味物質，也可利用其對映體比例的不同作為區分白酒風格的依據，當然，這需要建立在大量、系統的數據基礎之上。此外，由于外源性香料的添加會改變天然發酵酒體原有的對映體比例，有研究人員通過檢測葡萄酒中1,2-丙二醇的對映體比例就可以鑒別天然葡萄酒出現香氣摻假的現象[22]，考慮到乳酸乙酯和2,3-丁二醇是常用的白酒風味物質添加劑[5,23]，可改善白酒的風味口感，因此，研究不同來源白酒中乳酸乙酯、2,3-丁二醇含量及對映體分布可作為白酒品質鑒別及產地溯源的一個具有較高應用價值的評判依據。