礦質離子螯合肽自組裝遞送體系研究進展

尹樂斌，廖聰，劉丹，楊愛蓮，劉椏麗，何平，李樂樂

1(邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南 邵陽，422000)2(豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南 邵陽，422000)

蛋白質與多肽由可修飾的生物分子構成，能與其他結構單元相互自組裝成為超分子結構，這種物理化學現象可通過配位鍵、離子鍵、親水作用、疏水作用、靜電作用、π-π堆積等作用實現[1]。礦質離子螯合肽是一類可通過配位鍵與礦質離子自發組織或聚集為穩定結構的一類肽[2]，礦質離子不僅影響肽的空間結構，還與生物大分子識別、自組裝、生物功能等特征有密切關系。

鈣、鐵、鋅、硒、銅、鉻等礦質元素對人體生長、發育、繁殖等必不可少，密切關系著機體健康。鈣是人體必需元素，占體重1.5%～2.0%，對骨代謝、神經傳遞、肌肉收縮和凝血等功能至關重要[3]；鉻離子可協同葡萄糖耐受因子和增強胰島素作用從而影響糖類、蛋白質、脂類核酸代謝[4]；鐵離子是實現和維持血紅蛋白適當水平的重要底物[5]；鋅是大量酶的催化組分，在許多肽、蛋白質、細胞因子及激素中有生物學及構效作用[6]；硒有抗癌、抗氧化、抗病毒、增強免疫和預防心血管疾病等方面的潛能，被譽為“生命的火種”[7]。傳統的無機礦質元素補充劑和有機礦質補充劑存在刺激胃腸道、吸收率低等缺點。肽-礦質離子螯合物因其特有的組裝模式和吸收機制，在機體中可持續解離，具有易吸收、安全無毒、穩定性好等優點[8]。近年研究表明，肽-礦質離子螯合物還具有抗氧化、抑菌、降血糖、免疫調節和保護肝臟等功能。因此，肽-礦質離子螯合物的應用涉及食品保健、醫藥、農業、畜牧業、抗菌添加等方面，具有巨大發展潛力。

1 多肽-礦質離子螯合物的來源及制備與生理活性

1.1 多肽-礦質離子螯合物的來源及制備

肽-礦質離子螯合物可從3個方面制備：人工制備的礦質離子螯合肽與各類礦質離子組裝；天然蛋白質酶解獲得的具有螯合能力的多肽與各類礦質離子組裝；從動植物中直接提取天然肽-礦質離子螯合物[2]。富硒水稻就是硒直接與植物中多糖或蛋白質結合用于補充人體硒。BOYLE等[9]將組氨酸殘基引入卷曲螺旋三聚體的疏水核心設計出一種肽，會在加入礦質離子時自組裝。天然蛋白質酶解獲得礦質離子螯合多肽與各類礦質離子配合來制備螯合物更易于獲取與應用，且條件溫和、成本低、安全易控制，是發展的必然趨勢。有研究報道了來源于不同動植物、乳類、微生物和水產資源中獲得的能與礦質離子組裝的多種食物源多肽(表1、表2)。蛋白質水解產生的水解物具有不同的分子質量和不同的生物特性，不同的蛋白酶和作用蛋白的性質不同，酶切結果也不同，料液比、溫度、pH、酶的添加量、時間等各因素間交互作用也對水解蛋白的過程有所影響。蛋白質可在微生物所產生的多種酶、酸及特定代謝的作用下進行水解，因此微生物發酵法也是制備多肽的基本方法。一些食品加工副產物為微生物生長提供營養來源，可實現資源高效利用。隨著科學技術的發展，近年研究者傾向于從粗肽研究轉向更高純度多肽的研究，CANABADY-ROCHELLE等[10]建立了表面等離子體共振篩選多肽的方法，可定向得到高礦質螯合能力的肽。

1.2 礦質離子螯合多肽的生理活性

1.2.1 礦質元素遞送活性

多肽礦質離子螯合物克服了礦質離子低濃度時的低生物利用度和高濃度時的生物毒性等兩大限制。多肽和氨基酸螯合的礦質離子在人體消化道可溶且呈電中性，而礦質離子的吸收取決于其螯合配體，與氨基酸相比，小肽的吸收有輸送速度快、載體不易飽和、耗能少等優點[11]。肽-礦質離子螯合物因其獨特的組裝形式和吸收機制，在腸道內結構更為穩定，可以避免礦質元素沉淀的形成，從而促進礦質離子的吸收和利用。CAI等[12]通過Caco-2細胞研究發現,多肽-鈣螯合物與無機鈣組相比，Caco-2細胞單層鈣吸收要提高3倍以上。菅景穎等[13]發現與葡糖酸鈣和CaCO3等補鈣制劑相比，膠原多肽螯合鈣在小鼠質量、股骨長度、骨鈣、骨磷以及有機質含量方面均顯著高于其他補鈣劑。

1.2.2 抗氧化活性

表1 不同來源的礦質離子螯合肽與礦質離子螯合物的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of peptides and mineral ion chelates from different sources

1.2.3 抑菌活性

小分子肽分子質量小，結構緊密，易于進入微生物細胞，因而能迅速地影響微生物的生長，近年研究表明多肽-礦質離子螯合物具有較強的抑菌活性。楊玉蓉等[24]研究表明小分子質量(≤5 kDa)桃仁多肽PKP3組分與亞鐵離子螯合后的抑菌活性強于大分子質量(≥10 kDa)桃仁多肽亞鐵螯合物，小麥多肽螯合亞鐵和桃仁多肽螯合亞鐵對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度分別為5.0、2.5 mg/mL，對大腸桿菌最小抑菌濃度均為5.0 mg/mL。蒲傳奮等[25]制備的玉米醇溶蛋白肽鈣通過破壞細胞膜影響大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的正常生長曲線從而起到抑制作用。KESSLER等[26]則通過實驗證明金屬鋅螯合肽衍生物對銅綠假單胞菌彈性蛋白酶具有體外抑制作用。

1.2.4 其他生物活性

肽-礦質離子螯合物還具有降血糖、保護肝臟、免疫調節等作用。PAULE等[27]發現多肽GHTD和ISF402與鋅螯合后體內降血糖能力強于單獨使用胰島素，這是由于這類多肽鋅可改變胰島素的六聚體結構，增強胰島素降血糖能力。王秀麗等[28]發現膠原肽鉻可顯著降低血糖，增加肝糖原的合成及葡糖糖激酶活性。王衛國等[29]用納米小肽螯合銅喂養小鼠，測定小鼠血清中生長因子(IGF-1)、小鼠白介素(IL-2)及血清免疫蛋白IgG、IgM和IgA的含量，得出肽-銅螯合物可提高機體免疫力的結論。SUPATCHA等[23]從米糠蛋白中分離出了具有酪氨酸酶抑制活性與銅螯合活性的多肽SSEYYGGEGSSSEQGYYGEG，可在食品和化妝品中發揮作用。

2 礦質離子螯合多肽自組裝模式

較多肽與礦質離子的螯合機理研究針對于磷酸鹽基團結合模式和羧酸鹽基團結合模式，礦質離子螯合肽的羧基、氨基以及側鏈含具有孤對電子的氮、氧、硫原子可作為結合位點，在一定條件下可與礦質離子配位結合形成絡合物。此外，外界環境、帶電量及分子質量大小都會影響多肽與礦質元素的結合常數和結合位點，同時礦質螯合物的結構性質也相應發生改變[30]，部分不同來源礦質離子螯合多肽與礦質離子螯合的結構表征分析見表2。

表2 不同來源多肽與礦質離子自組裝結構表征Table 2 Characterization of self-assembled structure of peptides and mineral ions from different sources

2.1 磷酸鹽基團組裝模式

酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides，CPP)和卵黃高磷磷酸骨橋蛋白肽(phosvitin phosphopeptides，PPP)是最早被發現的促鈣吸收肽。CPP是乳中酪蛋白的酶解產物，活性中心結構為-Ser P-Ser P-Ser P-Glu-Glu-，能與多種礦質離子組裝并促進其吸收[41]。PPP絲氨酸含量大于30%，磷占比達8.2%，由卵黃高磷蛋白酶解而得[42]。磷酸化絲氨酸能將鈣離子包裹而形成可溶性復合物，避免了鈣在人體腸道內與植酸鹽形成沉淀[43]。SATO等[44]發現礦質離子螯合肽與鈣離子的結合與磷酸化絲氨酸基團呈正相關，且酪蛋白分子的磷酸鹽部分對增強人體小腸吸收鈣離子有必要關聯。

2.2 羧酸鹽基團組裝模式

多種不含磷酸基團的多肽可通過氨基酸殘基中的天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸等羧基組裝礦質離子，羧基上的氧原子可通過提供孤對電子與礦質離子形成配位鍵。BAO等[45]研究了大豆蛋白水解物中鈣螯合能力和羧基含量之間的關系，結果表明，螯合鈣的量隨著羧基含量的增加而線性增加。LIU等[46]報道了來自小麥胚芽蛋白水解產物的谷氨酸和天冬氨酸羧基上的氧原子參與了多肽與鈣離子之間的螯合。大豆肽的研究表明，與羧酸基團結合的肽需要較大分子質量(3～10 kDa)，這種模式可能需要形成特定空間結構才能發揮活性[45]。

2.3 多肽-礦質離子螯合物空間結構

EF手性結構(圖1-a)和C2結構域是常見的由-loop-環結構所組成多肽結合空間模式。loop環中分布含氧側鏈的氨基酸，通過提供氧原子和氮原子的孤電子對與礦質離子配位形成新化合物，同時氨基酸側鏈螺旋旋轉改變空間位置，便于內部疏水基團暴露，獲得更多的識別位點[43]。WANG等[47]設計了3組由不同手性氨基酸組成、互為對映異構體的短兩親肽，超分子納米原纖維的扭曲手性由C末端的親水性Lys頭部的手性決定，而其特征圓二色譜信號則由疏水性Ile殘基的手性決定。BOYLE等[9]將組氨酸殘基引入到卷曲螺旋三聚體的疏水核中，產生了一種在添加金屬離子后自動組裝的HisAD肽，如圖1-c所示，HisAD在與Cu(II)絡合后折疊形成α-螺旋結構。C2結構域是在蛋白激酶C的鈣依賴亞型中鑒定出來[48]，如圖1-f，C2-結構域頂端的3個1oop環里面分布有天冬氨酸可與鈣離子形成β-三明治結構。也有研究提出鈣螯合物在溶液中的構象，其中鈣離子被4個共面碳原子纏繞在八面體型配合物中[49]，圖1-d為溶液中環[Glu(YOBzl)-Sar-Gly-(N-己基)Gly]z-鈣絡合物構象的Corey-Padi-Koltun分子模型。

WANG等[37]將Asn-Cys-Ser(NCS)和Ser-Met(SM)與Zn2+組裝，發現在多肽羰基和水的協調作用下，多肽的羧基、羥基和巰基與鋅離子形成穩固的配位鍵，圖1-b為兩種多肽的某一立體結構。有些多肽在酸性、受冷、受熱等環境下可聚集，為探究肽聚集對鈣結合能力的影響，LIU等[50]分離出了不同分子質量且具有不同鈣結合能力的多肽F1和F2，分析了去羧酸化處理前后多肽與鈣結合能力和表觀分子重分布的變化。結果表明，酸性氨基酸的疏水相互作用是肽聚集和鈣結合的主要驅動力，疏水氨基酸如Pro和Phe與鈣結合氨基酸如Glu和Asp分別在肽的兩側，如圖1-e所示，黃色箭頭指向發生疏水聚集的區域，橙色箭頭指向鈣結合區域。當2個分子的肽相遇，疏水氨基酸傾向于聚集和埋藏在分子內，將鈣結合氨基酸聚集在一起，在分子表面形成一個“鈣結合區”而提高鈣結合力。

圖1 多肽-礦質離子自組裝體系空間結構圖Fig.1 Space structure diagram of peptide-metal ion self-assembly system

2.4 礦質離子與肽的多元超分子結構

隨著納米生物技術的發展，生物活性分子構筑超分子組裝體的概念備受重視。實現對聚合物的可控組裝調控，對改進材料的效能和安全性意義重大。多糖類物質的組裝可以提供更多的結合位點，且有利于金屬離子或藥物在胃腸道的緩釋，同時可為機體提供活性成分。ZHU等[8]分別以脫鹽鴨蛋清肽、CPP和殼寡糖為材料，成功組裝了多種保護性鈣緩釋遞送載體，結果表明，遞送系統可促進鈣內流，受試動物的血清和骨指標等顯著增加，且有效促進腸道有益菌的增殖，促進代謝產物如丁酸含量提高。夏偉榮等[51]以馬脾脫鐵鐵蛋白(horse spleen apoferrin,HSF)及海藻酸鈉(sodium alginate,SA)為載體材料包埋血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽Ala-His-Leu-Leu(AHLL)，利用鐵蛋白在強酸條件下可逆組裝性質和多糖的控釋作用，通過HSF和SA靜電吸引形成良好的復合包埋載體制備均勻分散的HSF-ACE抑制肽及HSF-SA-ACE抑制肽納米復合體系，提高了AHLL在消化系統中的吸收效果。

3 多肽-礦質離子螯合物自組裝遞送體系生物利用度研究進展

以往的觀點認為，人體吸收的礦質離子取決于十二指腸和近端空腸在吸收位點處離子形式的可溶性礦質離子量，肽-礦質離子螯合物中的礦質離子通過競爭形式被吸收。隨著研究的深入，有學者提出肽-礦質離子螯合物以完整的結構進人循環系統的假說，此時機體通過肽通道吸收螯合物，可避免與其他礦質離子吸收的拮抗競爭，從而提高其生物利用度。鈣遞送體系的主要體內活性研究路線如圖2所示[8]：一般研究過程為構建礦質離子螯合肽的自組裝體系，并研究其結構表征，然后細胞模型與動物模型研究其促礦質離子吸收活性。ZHU等[8]在Caco-2細胞單層模型、Caco-2細胞群體模型和外翻腸囊模型中發現脫鹽鴨蛋白肽可增強鈣離子轉運，且可通過充當鈣離子載體與細胞膜相互作用以打開特定吸收通道實現促鈣吸收，且脫鹽鴨蛋白肽可抵抗植酸的不良影響。

上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號可通過增加體內肥大軟骨細胞中的β-連環蛋白(β-catenin)數量調節Wnt/catenin通路。YE等[52]對牦牛骨膠原衍生肽(GPAGPPGPIGNV，GP-12)體外穩定性研究表明，在模擬胃腸消化吸收(Caco-2細胞單層)實驗后，GP-12消化成更小的肽，然而它們仍可通過細胞旁路途徑實現Caco-2細胞單層完整吸收。如圖3所示，GP-12通過激活Wnt /β-catenin途徑與EGFR途徑之間的通路，誘導從G0/G1到S期以及從S到G2/M期的細胞周期進程的改變來完成成骨細胞增殖和分化。

圖3 Wnt/β-catenin途徑與EGFR途徑參與GP-12的成骨細胞增殖和分化相互作用模擬模型[52]Fig.3 Proposed model of the cross-talk between Wnt/β-catenin pathway and EGFR pathway involved in osteoblastic proliferation and differentiation by GP-12

4 展望

多肽-礦質離子自組裝遞送體系不僅可解決礦質元素在人體內吸收差和生物活性低的問題，同時也具有抗氧化、抗菌、免疫調節和降血糖等作用，具有很高的應用價值和開發前景。但目前用于工業生產的礦質離子螯合肽仍只有CPPs和PPPs，其他來源的礦質離子螯合肽投入在實際生產中的少之又少。且目前的研究只處于實驗室階段，存在成本高、產量低、純度不高等制約因素。關于多肽-礦質離子螯合物還存在系統安全性評估、活性機制、構效關系研究不全面的問題，近年來雖有較多細胞模型與小鼠活體模型為多肽-礦質離子螯合物在人體的轉運與影響奠定了一定基礎，但多肽-礦質離子螯合物對人體是否有同樣的效用還有待進一步研究。此外，蛋白質或多肽在多元超分子自組裝中有巨大潛力，蛋白質和多肽可以在水溶液分散納米膠束中進行自組裝，也可以通過靜電和疏水作用負載活性化合物，如花色苷，姜黃素和β-胡蘿卜素，且這些膠束在模擬胃腸液中具有很好的穩定性。將多糖、多酚、黃酮等生理活性物質與礦質離子螯合肽共建的復合自組裝遞送體系，構建膜、水凝膠、膠束、囊泡和納米顆粒及皮克林乳液等，對于遞送體系的穩定性及擴展更多活性具有重要意義，對促進礦質離子吸收和調節腸道微生物的食品材料以及藥物遞送和其他潛在功能等方面有廣闊前景。隨著對蛋白質及多肽自組裝研究的繼續深入，蛋白質和多肽的自組裝遞送體系的潛在功能也將被持續開發，在未來的食品領域中具有更廣闊的應用前景。