低聚原花青素對過度訓練大鼠骨骼肌損傷的保護作用機制

周海濤，曹建民，胡 戈，牛衍龍，龔 平，邵芙蓉，張子坤，黃景宣，董愛霞

(1.北京聯合大學生物化學工程學院，中國北京100023；2.北京聯合大學生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，中國北京100191；3.北京體育大學運動人體科學學院，中國北京100084；4.常州大學，中國江蘇常州213164；5.贛南醫學院，中國江西贛州341000)

研究表明，長時程、大強度運動可誘發過度訓練及運動性骨骼肌損傷[1～2]。氧化應激是過度訓練致骨骼肌損傷及運動能力下降的關鍵因素[3～4]。絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號系統在機體對環境應激適應及維持內部環境氧化/抗氧化動態平衡中發揮著重要作用。其中，p38 MAPK信號與運動及運動引發和加劇的氧化應激及骨骼肌損傷密切相關[5～6]。研究證實，長時程、大強度運動引發的過度訓練使得機體氧化應激反應加劇，自由基在體內過度堆積，MAPK系統活化，進而對骨骼肌功能造成損傷[1，7]。

原花青素(proanthocyanidins，PC)是蔬菜和水果中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，其低聚物——低聚原花青素(oligomerized proanthocyanidins，OPC)是目前國際上公認的天然抗氧化劑，可以高效清除機體內過量堆積的自由基，提高抗氧化酶活性，有效地拮抗大強度運動誘導的氧化應激，保護機體結構/功能[8]。但OPC能否通過調控MAPK信號通路相關蛋白質表達預防和延緩過度訓練大鼠骨骼肌損傷的相關研究尚未見報道。本研究以42 d遞增負荷跑臺訓練建立過度訓練致運動性骨骼肌損傷動物模型，期間以OPC進行營養干預，通過觀察大鼠骨骼肌組織形態，檢測過度訓練和骨骼肌損傷標志物及骨骼肌氧化應激水平、p38 MAPK信號通路相關蛋白質表達，探討了OPC改善過度訓練致運動性骨骼肌損傷的作用機制，發現OPC可通過改善氧化應激，調控p38 MAPK信號通路相關蛋白質表達，保護過度訓練大鼠骨骼肌結構/功能，這將為運動性骨骼肌損傷的防控提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

65只7周齡無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級 Wistar大鼠(雄性)源自北京大學醫學部實驗動物科學部，動物生產合格證編號:SCXK(京)2016-0010，平均體重為(250.1±13.9)g。實驗過程中，室內溫度保持在(22±2)℃，相對濕度控制在55%～75%，自然光照。所有實驗大鼠均在北京體育大學SPF級屏障系統(SYXK京2016-033)以基礎飼料[斯貝福(北京)生物技術有限公司，SCXK(京)2019-0010]和蒸餾水常規飼養，自由飲食。

1.2 藥物與試劑

OPC，純度≥95%，低聚體10%～45%(西安通澤生物科技有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)羥胺法試劑盒(南京建成生物工程研究所)；3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)、8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG)酶聯免疫試劑盒(上海迪奧生物科技有限公司)；睪酮(testosterone，T)和皮質酮(corticosterone，Cor)放射免疫試劑盒(北京華英生物技術研究所)；p38/p-p38 MAPK抗體(Sigma公司，美國)。

OPC以蒸餾水配制為30 mg/mL的溶液，4℃冰箱避光冷藏待用。

1.3 儀器

DSPT-202型動物跑臺(杭州段氏制造廠)，ISO9001型電子天秤(北京賽多利斯儀器系統有限公司)，NR-B17CC型超低溫冰箱(日本松下電器產業株式會社)，電動組織勻漿器(美國KIMBLE公司)，5417R低溫超速離心機(德國艾本德股份公司)，721紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，MultiSkan3 酶標儀(芬蘭雷勃公司)，r-911全自動放免計數儀(中國科學技術大學科技實業總公司)，RT2200C全自動生化分析儀(美國雷杜公司)，LEICA RM2016病理切片機(德國RM公司)，Pannoramic MIDI全自動數字切片掃描系統(匈牙利3D HISTECH公司)。

1.4 動物分組

實驗大鼠在適應性飼養4 d后，經3 d跑臺訓練(5 m/min、20 min/d)進行篩選淘汰。將剩余60只大鼠隨機分為3組:安靜對照組(C組，12只)、過度訓練組(OM組，24只)、OPC干預組(OOM組，24 只)。

1.5 過度訓練模型建立及營養干預方案

C組不進行任何運動，其他組進行42 d遞增負荷跑臺訓練以建立過度訓練模型。具體方案[9～10]見圖1。各組大鼠每天于訓練前1 h灌胃1次。其中，OOM組根據預實驗并參考文獻[8]以150 mg/(kg·d)和5 mL/kg的劑量及體積灌胃OPC，其他組灌胃等體積的蒸餾水。

圖1 大鼠跑臺訓練方案[9]從第2周開始，每次訓練初始速度為10 m/min，每5 min增加5 m/min，直至本周目標強度。最后1周訓練，大鼠若無法維持目標強度，則運動至力竭。Fig.1 Treadmill training program of rats[9]From the second week，the initial speed of each training was 10 m/min，and the speed increased by 5 m/min every 5 min until the target speed of that week was reached.During the last week of training，if the rats could not maintain the target speed，they would exercise to exhaustion.

1.6 取材

受訓練強度/頻度、疲勞恢復等多重因素影響，實驗動物出現意外死亡。實驗結束時，OM、OOM組大鼠分別剩余11只和14只。

大鼠末次跑臺訓練結束后即刻采用2%戊巴比妥鈉溶液對其進行麻醉，腹主動脈放血處死。收集全血5 mL，37℃自然凝固，待血清出現后于冰箱4℃存放24 h。4℃、3 000 r/min離心10 min，分離制備血清，并將其置于-20℃冰箱中保存待測。

分離出大鼠兩側完整的比目魚肌，以4℃的生理鹽水進行漂洗，快速去除血液及其他結締組織，吸干水份后切取右側組織300 mg，均勻地分為3份，以錫紙包裹標記后裝入密封袋，并立即投入液氮中，隨后放入-80℃超低溫冰箱保存，待測SOD活性以及MDA、3-NT、8-OHdG含量。

切取部分左側組織，修整為0.5 cm×0.5 cm×1 cm組織塊，置入組織固定液中固定24 h后包埋，切片后用于p38 MAPK信號通路相關蛋白質表達水平的免疫組化檢測及骨骼肌組織病理變化的HE染色和觀察。

1.7 相關指標檢測

400倍光學顯微鏡下進行骨骼肌組織形態學觀察。骨骼肌SOD活性采用羥胺法測定，MDA含量采用TBA法測定，3-NT和8-OHdG含量采用酶聯免疫吸附測試法測定，血清肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性采用全自動生化分析儀測定，血清T和Cor采用放射免疫法測定。

p38-MAPK及p-p38 MAPK的蛋白質表達水平采用免疫組化法測定:石蠟切片經梯度乙醇脫蠟后進行抗原修復，加入3%過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶，使用牛血清蛋白室溫封閉30 min，加入一抗(稀釋比1︰100)4℃孵育過夜，清洗后加入二抗室溫孵育50 min，再次清洗后采用二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復染，最后脫水封片。采用數字病理切片掃描儀對每張切片進行全視野數字掃描，細胞核染色為深棕色、棕黃色、淺黃色和藍色時分別對應強陽性、中度陽性、弱陽性和陰性，對陽性細胞數量及染色強度進行分析記錄，識別出陽性細胞面積，應用公式計算H-score以便定量分析[11]。H-score=(強陽性細胞密度×3)+(中度陽性細胞密度×2)+(弱陽性細胞密度×1)。

1.8 數據統計

采用SPSS 22.0軟件對所有數據進行處理，數據以平均值±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 42 d遞增負荷跑臺訓練及OPC干預對大鼠T/Cor比值的影響

血清T/Cor比值是運動人體科學領域評價運動負荷狀況及診斷過度訓練的金標準[12]。為評測過度訓練動物模型是否成功建立及OPC的干預效果，本實驗對各組大鼠血清T及Cor的水平進行了檢測。表1顯示:對組間血清T水平而言，OM組較C組極顯著降低(P＜0.01)，OOM組較OM組極顯著升高(P＜0.01)；對組間血清Cor水平而言，OM組較C組極顯著升高(P＜0.01)，OOM組較OM組極顯著降低(P＜0.01)；對組間血清T/Cor比值而言，其變化趨勢與血清T的變化趨勢相一致。從表1數據可知，OM組大鼠T/Cor比值較C組下降86.48%，達到相關過度訓練診斷標準(血清T/Cor比值下降30%以上)[12]，說明本實驗采用的42 d遞增負荷跑臺訓練方案成功建立了過度訓練模型。同時，OOM組T/Cor比值較OM組大幅提升，但與C組比較其下降幅度仍達到37.76%，說明OPC干預在一定程度上可緩解和改善長時程、大強度運動所致過度訓練。

表1 運動及OPC干預對大鼠血清T/Cor水平的影響Table 1 Effects of exercise and OPC intervention on serum T/Cor levels of rats(±s)

表1 運動及OPC干預對大鼠血清T/Cor水平的影響Table 1 Effects of exercise and OPC intervention on serum T/Cor levels of rats(±s)

注:與C組比較，**表示具有極顯著性差異(P＜0.01)；與OM組比較，##表示具有極顯著性差異(P＜0.01)。Notes:**P＜0.01 vs.C group；##P＜0.01 vs.OM group.

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 T/(n g·m L-1)1.7 8±0.7 3 0.4 8±0.1 3**1.2 4±0.6 5##C o r/(n g·m L-1)2 3.7 9±3.9 2 4 5.9 3±6.9 4**3 0.1 3±8.4 0##T/C o r(1 0-2)8.2 1±4.4 2 1.1 1±0.4 5**5.1 1±3.5 8##

2.2 42 d遞增負荷跑臺訓練及OPC干預對大鼠骨骼肌SOD活性和MDA、3-NT、8-OHdG含量的影響

研究表明，SOD活性可以有效反映機體抗氧化能力[13]；MDA可以敏感地反映體內脂質過氧化水平[1]；3-NT和8-OHdG則分別是蛋白質和DNA氧化應激損傷的標志物[14]。這些指標能夠直接或間接反映骨骼肌氧化損傷程度。為此，本實驗選擇以上指標評測6周遞增負荷跑臺訓練致過度訓練及OPC干預對大鼠骨骼肌抗氧化應激能力的影響。表2顯示:在SOD活性方面，OM組較C組顯著降低(P＜0.05)，OOM 組較 OM 組極顯著升高(P＜0.01)；在MDA、3-NT和8-OHdG含量方面，OM組較C組極顯著升高(P＜0.01)，OOM組較OM組顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。以上數據提示:6周遞增負荷跑臺訓練誘發大鼠過度訓練的同時導致大鼠骨骼肌出現多層面氧化應激損傷；OPC干預可以有效提升大鼠骨骼肌抗氧化和清除自由基的能力，預防和延緩氧化應激損傷的發生與發展。

表2 運動及OPC干預對大鼠骨骼肌SOD活性和MDA、3-NT、8-OHdG含量的影響Table 2 Effects of exercise and OPC intervention on SOD activity and the contents of MDA，3-NT and 8-OHdG in rat skeletal muscle(±s)

表2 運動及OPC干預對大鼠骨骼肌SOD活性和MDA、3-NT、8-OHdG含量的影響Table 2 Effects of exercise and OPC intervention on SOD activity and the contents of MDA，3-NT and 8-OHdG in rat skeletal muscle(±s)

注:與C組比較，*表示具有顯著性差異(P＜0.05)，**表示具有極顯著性差異(P＜0.01)；與OM組比較，#表示具有顯著性差異(P＜0.05)，##表示具有極顯著性差異(P＜0.01)。Notes:*P＜0.05，**P＜0.01 vs.C group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs.OM group.

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 S O D/(U·m g-1)5 6.5 0±3.1 1 5 3.1 5±2.9 7*6 1.8 5±4.5 9##M D A/(n m o l·m g-1)0.9 0±0.2 1 1.2 5±0.2 2**0.7 4±0.1 4#3-N T/(n m o l·L-1)4 7.7 4±2 1.3 4 8 0.1 2±2 1.0 3**5 8.6 3±2 3.9 1#8-O H d G/(n g·L-1)1 2.1 6±1 3.1 9 3 6.6 4±9.2 8**1 8.1 5±6.1 5##

2.3 42 d遞增負荷跑臺訓練及OPC干預對大鼠骨骼肌p38 MAPK信號通路相關蛋白質表達的影響

p38 MAPK是MAPK信號系統中重要的信號通路，在保持機體內氧化/抗氧化動態平衡和運動信號轉導中發揮重要作用。運動中肌肉收縮可激活p38 MAPK信號通路，且運動強度與p38 MAPK激活程度呈正相關[1]。同時，p38 MAPK的活化與過度訓練致運動性骨骼肌損傷密切相關[15]。為此，本實驗檢測了骨骼肌p38 MAPK的蛋白質表達水平及其磷酸化水平，以評價42 d遞增跑臺訓練對骨骼肌的損傷程度及OPC的干預效果。從表3和圖2的結果可知，OM組p38 MAPK及其磷酸化水平均顯著高于C組(P＜0.05)，同時OOM組顯著低于OM組(P＜0.05)，說明42 d遞增負荷跑臺訓練激活了p38 MAPK信號通路，使p38 MAPK磷酸化水平升高，同時p38 MAPK蛋白過度表達；OPC干預可以有效抑制p38 MAPK信號通路的活化并下調p38 MAPK蛋白的過度表達。

圖2 各組大鼠骨骼肌p38 MAPK和p-p38 MAPK的表達情況(免疫組化分析，400×)C:安靜對照組；OM:過度訓練組；OOM:OPC干預組(標尺:20 μm)。采用免疫組織化學(石蠟切片)法檢測p38 MAPK和pp38 MAPK的蛋白質表達水平。蛋白質表達分析以切片陽性細胞數和染色強度為依據。顯微鏡下視野細胞核陽性由強至弱依次為深棕色、棕黃色、淺黃色，藍色為陰性。Fig.2 Expressions of p38 MAPK and p-p38 MAPK in rat skeletal muscle in each group(IHC，400×)C:Control group；OM:Overtraining group；OOM:OPC treatment combined with overtraining group(scale bar:20 μm).Immunohistochemistry analysis(paraffin section)was employed to test the expressions of p38 MAPK and p-p38 MAPK.Analysis of protein expression was based on the number of positive cells and staining intensity in the sections.Under the microscope，the positive nuclei of skeletal muscle cells(from strong to weak)were dark brown，brownish yellow and light yellow，respectively，and the negative ones were stained blue.

表3 運動及OPC干預對大鼠骨骼肌p38 MAPK/p-p38 MAPK表達的影響Table 3 Effects of exercise and OPC intervention on p38 MAPK/p-p38 MAPK expressions in rat skeletal muscle(±s)

表3 運動及OPC干預對大鼠骨骼肌p38 MAPK/p-p38 MAPK表達的影響Table 3 Effects of exercise and OPC intervention on p38 MAPK/p-p38 MAPK expressions in rat skeletal muscle(±s)

注:與C組比較，*表示具有顯著性差異(P＜0.05)；與OM組比較，#表示具有顯著性差異(P＜0.05)。表4注釋相同。Notes:*P＜0.05 vs.C group；#P＜0.05 vs.OM group.These are same in the Table 4.

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 p 3 8 M A P K 1 5 5.0 9±2 5.4 8 2 4 0.6 1±3 3.6 2*1 8 0.5 0±2 6.5 0#p-p 3 8 M A P K 1 0 8.3 7±1 9.7 0 1 5 8.9 4±2 7.5 8*8 6.9 4±2 5.6 4#

2.4 42 d遞增負荷跑臺訓練及OPC干預對大鼠骨骼肌組織形態的影響

病理診斷是骨骼肌損傷診斷的金標準[2]。圖3顯示:400倍光鏡下，C組大鼠骨骼肌形態正常，細胞核未見腫脹、固縮現象；OM組骨骼肌肌纖維間細胞增生，大量炎性細胞浸潤，血管周圍膠原增生嚴重；OOM組大鼠骨骼肌損傷程度較OM組明顯改善，僅出現輕度炎性細胞浸潤。上述結果說明，6周遞增負荷跑臺訓練誘發過度訓練的同時引發大鼠骨骼肌組織形態出現病理性改變；OPC干預可以在一定程度上對運動損傷起到預防和緩解的作用。

圖3 各組大鼠骨骼肌的組織形態學變化(HE染色，400×)C:安靜對照組；OM:過度訓練組；OOM:OPC干預組(標尺:20 μm)。紅色箭頭:血管周圍膠原增生；黃色箭頭:炎性細胞浸潤。Fig.3 Pathological changes in skeletal muscle in each group of rats(HE，400×)C:Control group；OM:Overtraining group；OOM:OPC treatment combined with overtraining group(scale bar:20 μm).Red arrow:Perivascular collagen hyperplasia；Yellow arrow:Inflammatory cell infiltration.

2.5 42 d遞增負荷跑臺訓練及OPC干預對大鼠血清CK、LDH活性的影響

體育實踐中，人們常以機體運動后血液循環系統中CK、LDH等骨骼肌細胞滲出物濃度來評價骨骼肌損傷程度及機體對運動負荷適應與疲勞恢復程度[16]。為此，本實驗選用二者評價42 d遞增負荷跑臺訓練致過度訓練及OPC干預對骨骼肌損傷程度的影響。表4顯示:在CK活性方面，OM組較C組顯著上升(P＜0.05)，OOM組較OM組顯著下降(P＜0.05)；在LDH活性方面，OM組較C組顯著上升(P＜0.05)，OOM組較OM組呈現下降趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。這說明6周遞增負荷跑臺訓練誘發過度訓練的同時導致大鼠骨骼肌損傷；訓練期間的OPC干預可以有效改善和緩解骨骼肌損傷。

表4 運動及OPC干預對大鼠血清CK和LDH酶活的影響Table 4 Effects of exercise and OPC intervention on serum CK and LDH activities of rats(±s)

表4 運動及OPC干預對大鼠血清CK和LDH酶活的影響Table 4 Effects of exercise and OPC intervention on serum CK and LDH activities of rats(±s)

G r o u p C O M O O M n 1 2 1 1 1 4 C K/(U·L-1)5 3 4.3 5±2 7 0.0 4 9 5 0.5 9±8 5.1 1*7 5 9.2 3±1 2 3.6 3#L D H/(U·L-1)1 0 7 3.6 1±2 1 8.2 1 1 7 8 3.3 5±4 2 6.3 2*1 5 0 4.7 2±4 1 3.2 4

3 討論

骨骼肌是機體最直接參與運動的器官，同時也是運動時主要供能和最大的耗能/耗氧器官[17]。研究表明，氧化應激是長時程、大強度運動所致骨骼肌損傷的主要發病因素[1～4]。MAPKs是運動中氧化應激主要的信號轉導通路，p38 MAPK的活化參與了運動應激特別是氧化應激致骨骼肌損傷的發生與發展[6]，運動強度及p38 MAPK活化程度與過度訓練致運動性骨骼肌損傷密切相關[1，6，15]。OPC通過清除體內過量堆積的自由基，提高抗氧化酶活性，可以有效地拮抗大強度運動誘導的氧化應激[8]，從而保護骨骼肌結構/功能，但具體作用機制尚不明確。

本實驗采用42 d遞增負荷跑臺訓練建立長時程、大強度運動致運動性骨骼肌損傷動物模型。實驗結果顯示，與C組比較，OM組血清T/Cor比值大幅下降，達到相關過度訓練診斷標準；骨骼肌組織形態發生病理性改變；血清中CK、LDH等骨骼肌損傷標志物的活性發生顯著性變化(P＜0.05)，說明建模成功。此外，OOM組血清T/Cor比值雖然未恢復到C組的水平，但是較OM組大幅度提升，同時OOM組大鼠骨骼肌組織形態、血清CK活性較OM組顯著改善，說明訓練期間的OPC干預在一定程度上可改善和緩解長時程、大強度運動所致過度訓練及骨骼肌結構/功能損傷。

研究表明，骨骼肌中SOD活性及MDA、3-NT和8-OHdG含量能夠從不同層面直接或間接反映骨骼肌氧化損傷程度[1，13～14]。p38 MAPK 信號通路與運動及其引發和加劇的氧化應激密切相關，而過度訓練引發的自由基過量堆積和機體抗氧化能力的下降是p38 MAPK活化和活性增加的重要機制[1，15]。本實驗中，與C組比較，OM組SOD活性顯著降低(P＜0.05)，MDA、3-NT 和 8-OHdG 含量極顯著升高(P＜0.01)，p38 MAPK及其磷酸化水平顯著提高(P＜0.05)，說明過度訓練加劇了氧化應激反應，使自由基過量生成，進而激活p38 MAPK信號通路。在Cho等[18]的研究中，可可原花青素通過阻止PC12細胞中p38 MAPK的活化，抑制過氧化氫誘導的細胞凋亡。Jia等[19]的研究發現，葡萄籽原花青素提取物有助于減輕HLE-B3細胞中過氧化氫引起的氧化應激，并可抑制MAPK信號通路的激活。Kim等[20]的研究認為，葡萄籽原花青素提取物可以抑制人類肺泡Ⅱ型上皮細胞(A549)中經由白介素-17介導的白介素-6的表達增多，這一過程是通過抑制p38 MAPK的磷酸化來實現的。本研究結果顯示，與OM組比較，OOM組SOD活性極顯著升高(P＜0.01)，MDA、3-NT 和 8-OHdG含量顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，p38 MAPK蛋白及其磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)。綜合以上信息可知，OPC干預可能通過有效地提高大鼠骨骼肌中抗氧化酶活性，提升機體抗氧化能力，從而清除長時程、大強度運動過程中過量產生的自由基，延緩或抑制氧化應激加劇，緩解其對骨骼肌造成的脂質過氧化反應及p38 MAPK信號通路蛋白質的過度活化和表達，最終多層面緩解過度訓練大鼠骨骼肌的結構/功能損傷。

4 結論

在本實驗條件下，OPC可以通過改善氧化應激，下調p38 MAPK/p-p38 MAPK的表達，保護過度訓練大鼠骨骼肌結構/功能。其具體機制可能是通過多層面、多靶點提升骨骼肌抗氧化能力，緩解長時程、大強度運動過程中過量自由基的產生和堆積，進而延緩或抑制氧化應激的加劇及p38 MAPK信號通路蛋白質的過度活化和表達。