大豆親脂蛋白熱誘導解離締合及自組裝納米顆粒表征

孫冰玉 劉琳琳 石彥國 朱秀清 張 娜 曾劍華

(哈爾濱商業大學食品工程學院， 哈爾濱 150076)

0 引言

熱處理是大豆食品加工過程中必不可少的操作單元，通過殺菌、鈍化抗營養因子等作用而獲得理想功能品質的產品[1-2]。熱處理使蛋白逐漸變性，蛋白分子歷經結構展開、解聚和再聚集等過程；形成的蛋白聚集狀態主要有無定性聚集和纖維化聚集兩種形式，其中無定性聚集是工業化熱處理過程中蛋白的主要聚集狀態；通常認為蛋白熱聚集過程中主要作用力為疏水相互作用、靜電引力、氫鍵和二硫鍵[3-5]。通過調控熱處理過程中蛋白亞基的解離締合反應、控制形成聚集體的狀態可以獲得具有優良功能性質的聚集體。文獻[6]研究顯示，在120℃條件下能誘導大豆分離蛋白形成可溶性無定型聚集體，其乳液具有優良的凍融穩定性[6]。

大豆親脂蛋白(Soybean lipophilic protein，SLP)是一種有別于大豆球蛋白和伴大豆球蛋白的富含磷脂高疏水性的大豆蛋白組分[7]，具有良好的物理和生物功能特性[8-10]。如SLP可通過物理作用而非生理調控降低血液膽固醇和三酰基甘油；SLP納米乳液可作為共軛亞油酸的輸送載體；SLP能顯著降低界面張力，并呈現出耐鹽耐熱性；添加0.1%的羥丙基甲基纖維素能提高SLP的乳化功能。文獻[11]研究發現，SLP與大豆蛋白的溶解行為具有相關性，從而推測SLP有可能是提高大豆分離蛋白溶解性和改善界面特性等功能的關鍵因素。近年來，自組裝納米顆粒引起了物理、化工和醫藥等領域學者的廣泛關注，即通過在納米尺度上調控粒子間的相互作用來控制粒子在整個組裝體上的分布，并著重于構建有序和復雜的結構。自組裝顆粒超級結構因具有不同于或優于基礎粒子結構的特性和功能，而被廣泛應用于藥物傳遞、催化、醫學診斷和傳感器等領域[12]。植物球蛋白(如大豆蛋白、玉米醇溶蛋白)因其具有良好的生物兼容性、可持續性和環境友好性而被廣大學者作為基礎材料用于蛋白納米顆粒自組裝研究[13]中。SLP具有明顯的親水、疏水核心，且具有較高的疏水性，強的疏水作用可以驅動SLP分子自組裝[14]。然而，目前關于熱處理過程中SLP的構象變化和納米顆粒自組裝行為的研究鮮有報道。

本文以SLP為研究對象，采用多光譜、熱分析技術、化學分析法和微觀成像技術表征熱誘導對SLP結構和納米顆粒自組裝的影響，以期為SLP專用大豆蛋白粉和SLP在食品領域的開發應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷榨大豆粕，黑龍江鶴旭食品有限公司；一級大豆色拉油，九三糧油工業集團有限公司。

三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、四甲基乙二胺、過硫酸銨、考馬斯亮藍 R250，分析純，上海索萊寶生物科技有限公司；正己烷、氯仿、甲醇、 β-巰基乙醇、甲醇、冰醋酸、甘氨酸(Gly)、尿素、 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(TDNB)、三氯乙酸(TCA)、 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、溴化鉀、溴酚藍，均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-3C型pH計，上海雷磁有限公司；79-1型磁力攪拌器，江蘇國華儀器廠；HH-4型恒溫水浴鍋，江蘇金壇宏華儀器廠；DYY-6D型電泳儀，北京六一電泳儀儀器廠；ALPHA 1-2 LD plus型冷凍干燥機，德國Christ公司；ALPHA 1650型紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司；Lambda365型紫外光譜儀、Spectrum Two型紅外光譜儀和DSC-4000型差示量熱掃描儀，美國珀金埃爾默股份有限公司；F-7000型熒光光譜儀，日本日立儀器(上海)有限公司；Chirascan CD型圓二色譜儀，英國應用光物理公司；Nano-ZS-90型馬爾文激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1SLP制備

SLP的制備參照文獻[15]，具體方法如下：冷榨豆粕在濃度為0.5 mol/L、pH值8.5的Tris-HCl緩沖液，55℃條件下水浴提取60 min，經4 000 r/min離心20 min，取上清液，將上清液pH值調至6.4靜置30 min，在4 000 r/min離心20 min；上清液pH值調至5.2靜置30 min后，將pH值調回至5.5，在4 000 r/min離心20 min分離出沉淀即為SLP；沉淀用適量去離子水溶解并將pH值調至7，透析48 h，冷凍干燥。

1.3.2熱誘導處理

將SLP粉末用10 mmol/L pH值7.2的PBS配制成蛋白質量濃度為10 mg/mL的溶液，在不同溫度條件(25～95℃)下分別誘導5、10、15、20、30 min；誘導結束后迅速冰水浴冷卻至室溫(20℃)并儲藏于4℃或冷凍干燥備用。

1.3.3巰基、二硫鍵含量測定

蛋白質巰基、二硫鍵含量參考Ellman試劑法[16]測定。

1.3.4粒徑和電位測定

取10 mg/mL的SLP上清液1 mL于PCS8501型石英測試池中，利用馬爾文激光粒度儀Trend程序升溫和程序降溫功能對SLP在熱誘導過程中粒徑和電位的變化進行實時監測，具體參數設置如下：溫度25～90℃、測試間隔為5℃、每個測試點平衡120 s、平行測量3次。

1.3.5紫外光譜

將樣品稀釋成質量濃度為0.1 mg/mL的溶液，10 000 r/min離心1 min，取上清液用于紫外光譜分析。波長為190～800 nm，分辨率為0.2 nm，掃描速率為600 nm/min。所得的一階紫外光譜通過Origin 2017軟件微分得到二級衍生紫外光譜。

1.3.6內源熒光光譜測定

將樣品液用pH值7.2的PBS稀釋為質量濃度0.1 mg/mL，在激發和發射狹縫均為5 nm、電壓為500 V條件下，以激發波長295 nm，從波長300～400 nm掃描得到熒光光譜，掃描3次取平均值最后得到內源熒光光譜圖。

1.3.7外源熒光光譜測定

取4 mL濃度為0.1 mol/L的蛋白樣品溶液，加入20 μL濃度為8 mmol/L的1-苯胺基-8-萘磺酸熒光探針，搖勻，靜置3 min；測試條件為：狹縫為5 nm、激發波長390 nm、掃描400～600 nm內熒光發射光譜。

1.3.8傅里葉紅外光譜

將凍干的SLP樣品置于干燥器內，充分干燥，精確稱取2 mg干燥的樣品，加入200 mg的KBr，進行研磨混合均勻，然后進行壓片，紅外光譜掃描，掃描波段4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數32。采集的紅外圖譜進行基線校正和平滑處理后，使用Peakfit 4.0.2結合Origin 2017對蛋白酰胺I帶(1 700～1 600 cm-1)做二階導數、去卷積和高斯曲線擬合，根據峰面積計算各種二級結構的相對含量。

1.3.9圓二色譜

將樣品用磷酸鹽緩沖液(pH值7.2，濃度0.01 mol/L)稀釋成質量濃度0.2 mg/mL，采用Chirascan CD圓二色譜在波長范圍為190～260 nm內掃描3次取平均值，光徑10 mm，掃描頻率為90 nm/min，間隔時間0.25 s，以相應磷酸鹽緩沖液為溶劑空白。

1.3.10聚丙烯酰氨凝膠電泳

聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析參照文獻[17]的方法，將2.0 mg/mL樣品與含有SDS和β-巰基乙醇的上樣緩沖液以體積比1∶1混合，沸水浴蒸煮10 min。上樣量均為20 μL，濃縮膠和分離膠質量分數分別為5%和12%，凝膠板厚度為15 mm，電泳緩沖溶液采用Tris-甘氨酸-SDS緩沖體系。Native-PAGE 電泳分析與SDS-PAGE電泳分析類似，不同的是樣品緩沖溶液及電泳緩沖溶液中無SDS和β-巰基乙醇，電泳緩沖溶液中無SDS，且上樣前也不經過加熱處理。

1.3.11掃描電鏡

取適量凍干后的樣品均勻粘在掃描電鏡觀察臺上，用Q150T ES型粒子濺射鍍膜儀給樣品鍍金，厚度約為15 nm，采用Hitachi S3400型掃描電鏡觀測，儀器觀測參數：加速電壓5 kV、放大倍數500倍。

1.4 數據處理

采用Excel 2013和SPSS 22.0對數據進行處理和顯著性分析，通過Origin 2017繪圖，實驗結果除有特殊說明外，均為3次平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 熱誘導對SLP結構影響分析

2.1.1熱誘導對SLP三級構象的影響

在280 nm附近的紫外吸收峰為蛋白芳香族氨基酸殘基特征吸收峰，因色氨酸紫外吸收峰較寬而基本掩蓋了酪氨酸的吸收峰，但蛋白酪氨酸和色氨酸殘基對苯丙氨酸氨基在250～270 nm處的吸收峰基本沒有影響，因而常規紫外光譜難以區分蛋白構象變化過程中酪氨酸和色氨酸的行為。紫外二階導數光譜在解析溫度、pH值和化學因子等引起蛋白精細結構變化中芳香族氨基酸貢獻具有重要作用，研究表明蛋白紫外二階導數光譜中酪氨酸和色氨酸殘基吸收峰的波峰和波谷的距離a(284～288 nm)和b(291～296 nm)的比值r(a/b)能表征蛋白構象變化構成中酪氨酸暴露程度[18-19]。

熱誘導對SLP紫外二階導數光譜的影響如圖1所示，當溫度高于90℃時，紫外二階導數光譜顯示SLP紫外二階導數吸收光譜發生1～2 nm藍移，但296 nm處未發生變化(數據未給出)；表明熱處理使得SLP埋藏于內部的酪氨酸殘基暴露于親水環境中。總體上，隨著溫度的升高，r呈先增大后降低的趨勢(圖1)，在90℃具有最大值，在該條件下SLP構象伸展至最大程度，即此時SLP微環境變得更加親水，酪氨酸暴露程度更高。

進一步采用內源熒光光譜分析熱誘導過程中由色氨酸和酪氨酸殘基微環境極性變化引起SLP三級構象的變化，熱誘導對SLP內源熒光光譜的影響如圖2所示，對外源熒光光譜的影響如圖3所示。與對照組(25℃)相比，基本上隨著熱誘導溫度和時間的增加，SLP的最大熒光強度(Fluorescence intensity，FI)逐漸下降(圖2f)；當溫度低于90℃時，熱誘導SLP最大吸收波長(λmax)發生明顯的藍移現象，表明SLP三維構象發生改變并且色氨酸和酪氨酸等發色基團微環境變得更疏水，原先暴露于表面的色氨酸等基團重新埋藏于SLP內部；當溫度高于90℃時，SLP的λmax顯著地向大波長方向移動；表明該條件下熱誘導SLP能逐步暴露出埋藏于SLP內部疏水環境的發色基團。文獻[20]研究也發現熱處理能使SPI的λmax發生紅移。

由圖3可知，SLP的表面疏水性指數隨著熱處理溫度和時間的增加而逐漸增大，表明熱處理過程中SLP分子逐漸暴露出埋藏于分子內部的非極性側鏈，這與內源熒光和紫外二階導數分析結果相一致；此外，文獻[21]研究也發現能量調控過程中能使SPI表面疏水性急劇增加。

2.1.2熱誘導對SLP二級構象的影響

研究顯示蛋白在熱誘導過程中會發生化學鍵的斷裂，如維持蛋白高級結構的氫鍵、范德華力等次級鍵以及維系亞型結構的二硫鍵斷裂使得蛋白聚集，從而使蛋白結構發生變化。熱誘導對SLP圓二色譜的影響如圖4a～4e(圖中CD值是指橢圓率)所示，短時間熱處理(5 min)后，SLP圓二色譜的譜型基本保持不變，表明SLP具有一定耐熱性，這與SLP中11S具有較高的熱穩定性有關；隨著熱誘導時間的增加，當溫度小于80℃時，SLP譜型基本類似；而當溫度大于80℃時，SLP的CD譜型發生顯著性改變，表明高溫處理能顯著改變SLP二級結構。文獻[22]研究顯示桑葚凝集素在低于80℃處理時，其CD譜型基本保持不變。隨著能量輸入，SLP的CD圖譜(圖4f)中218 nm處β-折疊峰型逐漸凸顯，表明熱誘導使得SLP的β-折疊結構含量增加。文獻[23]研究顯示熱誘導后α-突觸蛋白的β-折疊結構含量增加，且伴隨著表面疏水性增強，從而有助于蛋白自組裝行為的發生；因此，β-折疊結構含量增加可能與SLP解離締合行為密切相關。

2.1.3熱誘導對SLP構象穩定性的影響

天然SLP(25℃)的變性峰為74.63℃和92.88℃，對應焓值為0.99 J/g和3.44 J/g，如圖5(圖中ΔT表示溫度變化量，ΔH表示焓值變化量)所示，當熱處理溫度小于等于80℃時，SLP基本保持大部分天然蛋白構象，而100℃處理時，SLP基本變性。而當處理溫度為90℃時，DSC(差示掃描量熱分析)未檢測到7S變性峰，表明7S球蛋白基本都發生變性；而11S變性峰則逐漸增強，在熱處理20 min時變性溫度最大為95.14℃，同時也具有相對較高的焓值，為4.38 J/g，表明在90℃處理20 min冷凍干燥后保持一定的天然構象并且熱穩定性增加，持續的能量調控使蛋白解離，當能量調控結束后蛋白亞基重新締合或排列成結構熱穩定性更高的可溶性蛋白聚集體，這與FTIR結果分析一致。

綜上所述，由熱誘導對SLP構象影響可知，80～90℃范圍是SLP熱處理分界線，在熱處理溫度低于80℃時，在本次實驗數據范圍內，SLP能基本保持天然構象不發生顯著性變化，而在熱處理溫度高于90℃時，SLP蛋白二級構象發生顯著性改變，在90℃處理20 min時，SLP蛋白結構解聚伸展至最大程度，表面疏水性增加，分子間聚集程度增大，同時熱穩定性增強。

2.2 熱誘導SLP聚集體形成分析

蛋白質經熱誘導后維持蛋白高級結構的氫鍵、范德力等次級鍵以及維系亞型結構的二硫鍵斷裂使蛋白分子解離成亞基單位，從而引起蛋白高級結構發生變化；而當能量調控結束后，解離的亞基會重新聚集形成可溶性聚合物和難溶性聚合物，在90℃處理不同時間SLP的Native-PAGE和SDS-PAGE如圖6所示。

Native-PAGE顯示在90℃誘導SLP主要形成3個中間組分，分別為難溶性組分M1和高分子聚合物M2(180 ku以上)以及大分子聚合物M3(90.5 ku)；而SDS-PAGE顯示在原來形成的中間產物(M1～M3)位置完全消失，取而代之的是7S和11S的α、α′和β以及A3、A和B亞基，且主要為胱氨酸和半胱氨酸含量高的11S球蛋白亞基。這表明熱處理過程中SLP亞基經歷蛋白結構伸展、亞基解離并暴露出疏水性基團，而后SLP的亞基單位通過疏水相互作用和二硫鍵締合重新聚集形成中間產物。

通過測定在90℃加熱不同時間SLP的巰基和二硫鍵的變化可以進一步判定二硫鍵在熱處理過程中SLP亞基重新聚集的重要性程度。如圖7所示，短時間的能量調控(0～5 min)時二硫鍵和游離巰基含量無明顯變化，即表明此時SLP構象并未發生顯著性改變，這與本研究構象結構分析一致。當熱處理時間增加，可以發現游離巰基含量逐漸下降、而二硫鍵含量逐漸增加；這與圖6中M1～M3中間產物灰度隨著熱處理時間的延長而增加的現象相吻合；文獻[24]研究結果顯示苦杏仁蛋白在熱處理過程中亞基重新排列并通過二硫鍵形成分子質量在70～88 ku的中間產物。

2.3 熱誘導對SLP自組裝納米顆粒尺寸的影響

熱誘導形成SLP自組裝納米顆粒調控溫度的選擇受SLP變性溫度的影響。SLP有兩個變性溫度，分別為74.63℃和92.88℃，因SLP中11S球蛋白含量最多(質量分數約40%)，因此SLP具有相對較高的熱穩定性，如果想利用熱誘導形成SPL自組裝納米顆粒，就要選擇相對較高的調控溫度。由圖8(圖中濁度以600 nm處OD值表示)和表1可知，在60、70、100℃誘導處理SLP的PdI(多分散系數)大于0.2；而在80℃和90℃處理時SLP的多分散系數接近0.2并趨于單分布；相比80℃，在90℃處理時形成的SLP納米顆粒自組裝平均粒徑和表面電荷相對穩定，平均粒徑在100～110 nm、表面電荷在-23～-20 mV。隨著熱誘導時間的延長，SLP平均粒徑逐漸增大、Zeta電位絕對值逐漸減小并伴隨著濁度的升高，表明熱誘導SLP自組裝形成大量納米膠體顆粒。在90℃處理20 min時SLP能形成相對穩定的單分散納米顆粒。

表1 熱誘導對SLP納米顆粒自組裝的多分散系數和電位的影響Tab.1 Effect of heating induction on PdI and Zeta potential

在熱誘導過程中，SLP的Zeta電位呈下降趨勢，即SLP表面帶電量減少，從而引起蛋白分子之間靜電斥力減弱；但Zeta電位仍維持相對較大的數值(絕對值大于15 mV)，因而分子間靜電引力較弱，從而推測熱誘導引起SLP分子間聚集的主要作用力不是靜電引力。

SLP的程序升溫和程序降溫顯示SLP納米顆粒自組裝具有調控規律，如圖9所示，在溫度上升過程中，在55℃前粒徑基本保持不變，當溫度上升到60～90℃時，粒徑增大，這可能是蛋白受熱后結構得到適當伸展，導致粒徑增大；在90℃時粒徑急劇下降，這可能是維持蛋白亞型結構的次級鍵如氫鍵、范德華力以及二硫鍵斷裂導致SLP分子解聚形成亞基，從而導致SLP粒徑減小。在降溫過程中的初始階段(90～100℃)，可能是體系中仍維持有較高的能量，SLP粒徑變化較小，當溫度進一步下降時，在80℃時SLP粒徑急劇增大，這可能是因為當能量撤去后，氫鍵和范德華力以及二硫鍵的形成速率大于分解速率，SLP游離亞基逐漸聚集，且聚集程度隨著溫度降低而逐漸增大，從而表現出SLP粒徑增大；這與上文熱誘導對SLP構象影響分析結果相一致。

2.4 顯微成像分析

由圖10可知，天然SLP呈大小不一、棱角分明和質地相對密實的片狀；當SLP進行熱處理后(60～90℃)，如圖10b～10e所示，SLP結構變得相對疏松、棱角逐漸消失，顆粒細小化并呈均勻分布，這可能是熱誘導引起維持SLP高級結構作用力如氫鍵、二硫鍵斷裂，促使SLP分子亞基解聚形成分子量相對較小的顆粒。當熱處理溫度過高時(90℃以上)，SLP通過強烈的疏水相互作用聚集成更大的顆粒(圖10f)。此外熱處理后溶液中的SLP分子結構展開并暴露出更多的游離巰基和疏水性基團于分子表面，但在后續冷凍干燥過程中SLP的游離亞基通過游離巰基和疏水相互作用重新聚集形成較大的聚集體[25]。

綜上，綜合SLP在熱誘導過程結構變化規律、亞基解離締合行為以及粒徑的變化趨勢和微觀形貌結果，可推測90℃是SLP蛋白分子溫度的調控關鍵點。在熱處理過程中，SLP中維持分子結構穩定的氫鍵、范德華力等次級鍵和二硫鍵發生斷裂，蛋白結構伸展、解離，含有胱氨酸和半胱氨酸的側鏈暴露，表面疏水性增加，三級構象伸展程度最大，且二級構象顯著改變，并伴隨著β-折疊含量增加和-螺旋含量下降，分子間聚集程度增大，同時熱穩定性增強。暴露出的胱氨酸和半胱氨酸的巰基(—SH)在熱處理過程中氧化形成極不穩定的中間硫化物，并在冷卻過程中兩個相鄰的不穩定中間硫化物極易形成二硫鍵，從而生成了以二硫鍵和疏水相互作用為主要作用力的熱誘導中間產物(M1～M3)。在熱誘導20 min時，SLP可自組裝形成相對穩定的單分布納米顆粒體系，如圖11所示。

3 結束語

采用多光譜技術、熱分析技術以及凝膠電泳和動態光散射研究了熱誘導過程中SLP納米顆粒自組裝。結果顯示，80～90℃是SLP熱處理分界線，在熱處理溫度低于80℃時，SLP能基本保持天然構象，不發生顯著性變化，而在熱處理溫度高于90℃時，SLP蛋白二級構象發生顯著性改變。在90℃處理20 min時，SLP蛋白結構解聚、伸展至最大程度，表面疏水性增加。解離后的亞基通過二硫鍵和疏水相互作用重新聚集成中間聚集體，導致分子間聚集程度增大、構象穩定性增強。SLP自組裝形成粒徑約為110 nm的穩定單分布納米顆粒體系。