金絲桃苷改善膿毒癥模型大鼠心肌損傷作用機制研究

夏 駿，姚曉麗，劉 潭，劉伯毅△，方志成

（1. 十堰市太和醫院·湖北醫藥學院附屬太和醫院重癥醫學科，湖北 十堰 442000； 2. 湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北 十堰 442000）

膿毒癥是全身性有害炎性反應，死亡率高，多由多器官功能障礙和衰竭引發［1-2］，多表現為心功能不全［3］。目前，尚不清楚膿毒癥的病理生理學機制，故其治療是非特異性的且通常是無效的［4］。有研究表明，其發生機制通常與敗血癥性心肌功能障礙有關，包括過度氧化應激、心肌細胞凋亡、心臟收縮功能障礙和持續性炎癥［5］。缺氧誘導因子-1（HIF-1）調控著許多控制心血管系統所必需的細胞過程的基因，包括代謝、血管生成、細胞存活和氧傳遞［6］。HIF-1α 是HIF-1 的主要功能亞單位，可通過誘導血紅素加氧酶-1（HO-1）激活HIF-1α，使其具有心臟保護作用。HO-1 被認為是多種組織中對氧化應激和炎性反應最重要的心臟保護蛋白［7］。金絲桃苷為黃酮醇苷類化合物，具有抗炎、利尿、止咳等作用，可提高心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌超氧化物歧化酶（SOD）活力，改善心肌功能［8］，且可有效減少氧自由基生成，保護心肌。本研究中探討了金絲桃苷通過調節HIF-1α/HO-1 信號通路改善膿毒癥大鼠心肌損傷的作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器:PowerLab System 型分析系統（澳大利亞Instruments 公司）；Thermo ScientificTMMultiskanTMGO 型酶標儀（美國Thermo Fisher 公司）；BX53 型顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

試藥:地塞米松（STZ，美國Sigma 公司，純度為99.99%，批號為30648957）；肌鈣蛋白I（cTnI，批號為20649215），腦鈉肽（BNP，批號為20364952），腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號為20846213），白細胞介素1β（IL-1β，批號為20563214），酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，均購自上海優寧維生物有限公司；金絲桃苷（南京建成生物工程研究所，純度為99.99%，批號為190108）；二氨基聯苯胺（DAB）染色試劑盒（寶生物工程大連有限公司，批號為203695）；HIF-1α 和HO-1 蛋白抗體（美國Abcam 公司，批號分別為20136542，20613524）。

動物:SPF 級12 周齡SD 大鼠120 只，體質量為210 ～280 g，雌雄各半，購自重慶醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK（渝）2018-0003，動物使用許可證號為SYXK（渝）2018-0027，動物質量合格證號為001906127。試驗期間所有大鼠均飼養于清潔級動物房內，溫度為18 ～25 ℃，相對濕度為60% ～70%，動物自由取食、飲水，自動控制光照/黑暗交替（12 h/12 h）。本研究已獲得十堰市太和醫院倫理委員會審查和批準，符合動物倫理學標準要求。

1.2 動物建模、分組及給藥

選取120 只SD 大鼠，采用隨機數字表法分為正常對照組（A 組）、模型組（B 組）、陽性藥對照組（C 組，地塞米松10 mg/kg），金絲桃苷低、中、高劑量組（D1、D2、D3組，生藥10，20，40 mg/kg），各20 只。各組大鼠在禁食、禁飲12 h 后，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/kg，麻醉后消毒腹部皮膚，在腹部縱切3 cm 切口，打開腹腔，分離大鼠盲腸；A 組不作其他處理，縫合傷口，其余各組結扎盲腸末端，使用9 號針頭刺穿盲腸3 次，輕壓使糞便溢出，關閉腹腔，縫合傷口。術后，D1組、D2組、D3組和C 組腹腔注射相應藥物，A 組、B 組腹腔注射等體積生理鹽水，給藥1 次，12 h 后處死動物。12 h 內各組大鼠提供相同的飼養環境和飲食。

1.3 觀察指標

血流動力學:使用肝素鹽水（500 U/mL）填充導管，從右頸動脈將導管插入左心室，使用PowerLab 記錄左室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室內壓最大上升速率（＋dp/dtmax）和左心室內壓最大下降速率（-dp/dtmax）。

血清及心臟組織炎性因子:試驗末期，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/kg，取大鼠心臟非抗凝血3 mL，4 ℃離心（2 500 r/min）15 min，取上層血清置新的1.5 mL EP 管中，-80 ℃保存，備用。稱取大鼠心臟組織0.1 g，置玻璃研磨器中，加入1 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），充分研磨，4℃離心（2500r/min）15min，取上層血清，-80 ℃保存，備用。按ELISA 試劑盒說明書方法檢測血清中cTnI及BNP 和心臟組織上清液中TNF-α 及IL-1β 含量。

心臟病理組織切片:試驗末期，腹腔注射10%水合氯醛，取大鼠心臟組織，生理鹽水漂洗，置甲醛水溶液中固定，48 h 后取部分心臟組織制作蘇木精-伊紅（HE）染色切片，顯微鏡下觀察大鼠心臟結構病理變化。

心臟HIF-1α 和HO-1 蛋白表達水平:取心臟病理組織切片的組織蠟塊，切成5 μm 厚度，置防脫載玻片上，經脫蠟（二甲苯）、水化（梯度乙醇）處理后進行如下操作，PBS 浸泡3 次，每次5 min，晾干；將切片置枸櫞酸鈉緩沖液中，煮沸15 min，進行抗原修復，PBS 浸泡3次，每次5 min；3%雙氧水浸泡10 min，去除內源性酶，PBS 浸泡3 次，每次5 min；每張切片的組織上滴加50 μL山羊血清，封閉30 min；棄去山羊血清，不清洗，加50 μL一抗孵育，4 ℃過夜；次日，棄去一抗，PBS 浸泡3 次，每次5 min，晾干，滴加50 μL 二抗［生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）］孵育30 min；棄去二抗，PBS 浸泡3 次，每次5 min，滴加DAB 顯色劑，顯微鏡下觀察組織顏色，適時終止；用PBS 洗去DAB 顯色劑，滴加蘇木素復染5 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇（75%）溶液分化5 s，自來水沖洗5 min，藍化；依次經過70%，80%，90%，95%乙醇和無水乙醇各5 min，二甲苯20 min 后用中性樹脂封片。顯微鏡下觀察HIF-1α 和HO-1 蛋白表達水平。采用雙盲法判定免疫組化結果，由2 位未參與前期試驗且有病理工作經驗的工作人員在100 倍顯微鏡下采用半定量分析法統計蛋白表達結果。陽性細胞表達率，0 分為無表達，1 分為表達1% ～25%，2 分為表達25% ～50% ，3 分為表達50% ～75% ，4 分為表達75%以上；染色強度，0 分為無顏色，1 分為淺黃色，2 分為黃色，3 分為棕黃色。兩者得分相乘作為最后得分，0 分為-，1 ～2 分為＋，3 ～4 分為＋＋，5 ～6 分為＋＋＋，＞6 分為＋＋＋＋。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 血流動力學指標

與A 組比較，B 組LVSP，＋dp/dtmax，-dp/dtmax均顯著降低，LVEDP 顯著升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組、D3組LVSP，＋dp/dtmax，-dp/dtmax均顯著升高，LVEDP 顯著降低（P ＜0.05），且呈劑量依賴性（P ＜0.05）；與C 組比較，D1組、D2組LVSP，＋dp/dtmax，-dp/dtmax均顯著降低，LVEDP 顯著升高（P ＜0.05），D3組無顯著差異（P ＞0.05）。詳見表1。

表1 大鼠血流動力學指標比較（± s，n ＝20）Tab.1 Comparison of hemodynamic indexes of rats in each group（± s，n ＝20）

表1 大鼠血流動力學指標比較（± s，n ＝20）Tab.1 Comparison of hemodynamic indexes of rats in each group（± s，n ＝20）

注:與A 組比較，a P ＜0.05；與B 組比較，b P ＜0.05；與C 組比較，c P ＜0.05；與D1 組比較，d P ＜0.05；與D2 組比較，e P ＜0.05。表2 同。Note:Compared with those in group A，a P ＜0.05；compared with those in group B，b P ＜0.05；compared with those in group C，c P ＜0.05；compared with those in group D1，d P ＜0.05；compared with those in group D2，e P ＜0.05；as well as Tab.2.

組別A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組LVSP（mmHg）144.3±13.2 121.2±16.5a 141.7±11.9b 129.8±12.5bc 135.7±12.3bcd 141.3±15.7bde LVEDP（mmHg）8.1±1.2 13.4±1.5a 8.7±1.3b 11.3±1.5bc 10.1±1.7bcd 8.6±1.2bde＋dp/dtmax（mmHg/s）3 122.5 ±263.2 2 594.3 ±221.6a 3 097.2 ±279.6b 2 756.8 ±269.4bc 2 899.4 ±271.3bcd 3 092.5 ±286.4bde-dp/dtmax（mmHg/s）2 609.6 ±213.4 1 732.9 ±156.2a 2 586.7 ±231.5b 1 993.4 ±201.2bc 2 249.7 ±223.1bcd 2 593.6 ±247.5bde

2.2 血清及心臟組織炎性因子水平

與A 組比較，B 組cTnI，BNP，TNF-α，IL-1β 水平均顯著升高（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組、D3組cTnI，BNP，TNF-α，IL-1β 水平均顯著降低（P ＜0.05），且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與C 組比較，D1組、D2組cTnI，BNP，TNF-α，IL-1β 水平均顯著升高（P ＜0.05），D3組各指標無顯著差異（P ＞0.05）。詳見表2。

2.3 心臟組織病理結構

A 組大鼠心臟組織結構無明顯病理變化；B 組大鼠心肌細胞邊界模糊，細胞排列紊亂，可見大量炎性細胞浸潤和壞死區域；D1組、D2組可見少量炎性細胞浸潤，細胞結構及邊界較B 組明顯好轉；D3組和C 組心肌細胞排列整齊，細胞結構完整，邊界清晰，無炎性細胞浸潤。詳見圖1。

2.4 心臟組織HIF-1α 和HO-1 蛋白表達水平

與A 組比較，B 組HIF-1α 和HO-1 蛋白表達水平均顯著降低（P ＜0.05）；與B 組比較，C 組、D1組、D2組、D3組HIF-1α 和HO-1 蛋白表達水平均顯著升高（P ＜0.05），且呈劑量依賴性（P ＜0.05）；與C 組比較，D1組、D2組HIF-1α 和HO-1 蛋白表達水平均顯著升高（P ＜0.05），D3組無顯著差異（P ＞0.05）。詳見表3和圖2。

表2 大鼠血清及心臟組織炎性因子比較（± s，pg/mL，n ＝20）Tab.2 Comparison of inflammatory factors in serum and heart tissue of rats in each group（± s，pg/mL，n ＝20）

表2 大鼠血清及心臟組織炎性因子比較（± s，pg/mL，n ＝20）Tab.2 Comparison of inflammatory factors in serum and heart tissue of rats in each group（± s，pg/mL，n ＝20）

A 組B 組C 組D1 組D2 組D3 組cTnI 0.68±0.05 3.52±0.29a 0.95±0.11b 2.68±0.29bc 1.95±0.21bcd 1.01±0.12bde BNP 0.85±0.10 2.94±0.27a 1.01±0.11b 2.54±0.31bc 1.79±0.15bcd 1.04±0.10bde TNF-α 22.53±3.21 47.32±5.61a 24.21±2.65b 41.25±4.66bc 31.94±3.25bcd 24.55±2.73bde IL-1β 4.67±0.49 13.91±1.29a 5.75±0.61b 10.55±1.17bc 8.72±0.94bcd 5.78±0.58bde血清 心臟組織組別

表3 大鼠心臟組織HIF-1α 和HO-1 蛋白表達水平（半定量分析法）比較（只，n ＝20）Tab.3 Comparison of HIF-1α and HO-1 protein expression levels in heart tissues of rats in each group（semi-quantitative assessment，rat，n ＝20）

A.A 組 B.B 組 C.C 組 D.D1 組 E.D2 組 F.D3 組圖1 各組大鼠心臟組織病理圖（HE 染色，×200）A. Group A B.Group B C.Group C D.Group D1 E. Group D2 F.Group D3Fig.1 Histopathology of the heart tissues of rats in each group（HE staining，×200）

A.A 組 B.B 組 C.C 組 D.D1 組 E.D2 組 F.D3 組圖2 大鼠心臟組織HIF-1α 和HO-1 蛋白表達水平圖（免疫組化染色，×200）A. Group A B.Group B C.Group C D.Group D1 E. Group D2 F.Group D3Fig.2 The expression of HIF-1α and HO-1 protein in the heart tissue of rats in each group（immunohistochemical staining，×200）

3 討論

金絲桃苷可能通過HIF-1α/HO-1 信號通路減輕心臟免疫應激反應，從而減輕膿毒癥性心肌功能障礙。本研究中，膿毒癥大鼠心肌形態和功能的致命損傷表現為心肌結構破壞，心肌細胞凋亡，HIF-1α/HO-1活性，LVSP，dP/dtmax和-dP/dtmax水平均降低，LVEDP水平升高，腹腔注射金絲桃苷后，發現以劑量依賴的方式逆轉以上改變。表明金絲桃苷可能誘導心肌細胞HIF-1α 和HO-1 蛋白的表達，減少心肌細胞凋亡，減輕心臟氧化應激反應，預防膿毒癥性心功能不全，從而提高動物存活率。

膿毒癥是一種對感染者全身有害的炎性反應，主要導致患者肺功能障礙，其他器官如心臟和腎臟的功能障礙為繼發于肺功能的障礙［9-10］。一般情況下，心臟功能障礙（如心力衰竭、心律失常、心肌缺血）常繼發于腎功能或肺功能的突然惡化［11］，故感染性心功能不全發生后，應保護心臟免受心功能損害。

HIF-1α 具有心臟保護作用，因其為HO-1 的關鍵調節因子，HO-1 是組織中最重要的心臟保護蛋白之一［12-13］，催化血紅素氧化并產生CO、膽紅素和鐵蛋白，均有助于細胞抵抗氧化損傷和死亡機制，以上作用機制涉及過氧化氫酶的上調［14］。心臟特異性過表達中，HO-1 可減輕心肌缺血再灌注損傷［15］。此外，用HIF-1激活劑進行心臟預處理可減輕缺血后心肌損傷［16］。因此，HO-1 被認為可對缺血再灌注損傷提供即時和延遲保護。本研究中金絲桃苷呈劑量依賴性地誘導HIF -1α 和HO-1 蛋白的表達，這可能與降低脂質過氧化、心肌細胞凋亡、心肌母源抗體（MDA）水平及改善心功能有關。

現有研究證實，金絲桃苷可提高機體免疫力。一定劑量的金絲桃苷可顯著增強大鼠T 淋巴細胞和B 淋巴細胞的活性，調節相關炎性因子的分泌［17］。cTnI，BNP，TNF-α，IL-1β 等炎性因子與心肌受損程度密切相關［18］。本研究結果發現，在膿毒癥模型大鼠中，cTnI，BNP，TNF -α，IL -1β 的表達量均顯著增加，炎性因子的過度表達導致機體發生自身免疫性心肌損傷。腹腔注射金絲桃苷后，大鼠炎性因子的表達量均下調，且表達量與金絲桃苷劑量成反比，具有顯著的劑量-效應關系。表明膿毒癥可導致機體發生自身免疫性損傷，而金絲桃苷可通過調節機體免疫系統逆轉膿毒癥造成的損傷。

綜上所述，金絲桃苷對膿毒癥心肌損傷大鼠心臟具有一定保護作用。其作用機制可能是金絲桃苷通過誘導HIF-1α/HO-1 信號通路，激活膿毒癥大鼠HIF-1α和HO-1 蛋白的表達，從而減輕過強的免疫應答對機體造成的損傷，以扭轉膿毒癥導致的大鼠心肌損傷，為膿毒癥性心肌損傷的臨床治療提供理論依據。