銀連祛風湯對慢性蕁麻疹模型小鼠免疫指標的影響*

夏蔡虹，楊軍炎，盛國榮

（1. 江蘇省南通漢藥中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 南通 226001； 2. 江蘇省南通市第五人民醫(yī)院，江蘇 南通 226361）

慢性蕁麻疹是一種變態(tài)反應性疾病［1］，發(fā)病過程中單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、嗜酸性粒細胞趨化因子（Eotaxin）、白細胞介素4（IL-4）等細胞因子水平及T 淋巴細胞亞群CD4＋和CD8＋細胞陽性率將發(fā)生改變［2-3］。銀連祛風湯是治療慢性蕁麻疹的協(xié)定方劑，臨床療效顯著［4］。關于慢性蕁麻疹動物模型中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD4＋和CD8＋細胞陽性率等的報道較少，特別是同一動物模型中多種因子的表達水平更罕見。本研究中運用卵白蛋白＋氫氧化鋁制備慢性蕁麻疹小鼠模型，觀察銀連祛風湯對其MCP-1，Eotaxin，IL-4 蛋白相對表達水平，以及對CD4＋和CD8＋細胞陽性率的影響，以探討銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹的作用機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物:SPF 級KM 小鼠，日齡為28 ～32 d，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，購于南通大學醫(yī)學院實驗動物中心，動物合格證號為SCKX（蘇）2010-0023，動物許可證號為SYXK（蘇）2012-0031，實驗動物從業(yè)人員上崗證號分別為2100443，2091530。動物飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃、相對濕度為45% ～70%的動物房內(nèi)，自然光照。實驗室溫度為（25±1）℃，相對濕度為70%。

儀器:FACS Calibur 型流式細胞儀（美國BD 公司）；0412-1 型離心機（上海醫(yī)療器械＜集團＞有限公司手術器械廠）；ELr-800 型酶標儀（美國寶特公司）。

試藥:銀連祛風湯由銀花、連翹、丹皮各10 g，生石膏、生地、土茯苓、茵陳各30 g，白蒺藜20 g，地骨皮、地膚子、炒僵蠶各15 g，生甘皮5 g 組方；飲片購于南通三越中藥飲片有限公司，由南通市食品藥品檢驗中心龔旭東主任中藥師鑒定為正品；按處方推算，以體質(zhì)量60 kg 計，人體日攝入量為每日220 g 生藥，相當于生藥3.67 g/（kg·d）。地氯雷他定分散片（海南普利制藥股份有限公司，規(guī)格為每片5 mg，按體質(zhì)量60 kg 計，推薦攝入量為5 mg/d，相當于0.083 mg/（kg·d）；卵白蛋白（默克生命科學＜上海＞有限公司）；氫氧化鋁（AR級，源葉生物科技有限公司）；MCP-1，Eotaxin，IL-4 試劑盒（上海勁馬實驗設備有限公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）標記抗人CD4 抗體、藻紅蛋白（PE）標記抗人CD8 抗體試劑盒，均購于上海藍基生物科技有限公司。

1.2 方法

動物分組與造模:按隨機數(shù)字表法將72 只小鼠（雌雄各半）隨機分為6 組，即正常組（A 組），模型組（B 組），銀連祛風湯低、中、高劑量組［C1組、C2組、C3組，生藥18.35，36.70，55.05 g/（kg·d），即臨床用量的5，10，15 倍］，陽性藥對照組［D 組，地氯雷他定0.83 mg/（kg·d），即臨床用量的10 倍］，各12 只。用氫氧化鋁＋生理鹽水配制成氫氧化鋁懸液（1 g ∶1 mL），第1 天除A 組外其余各組小鼠均腹腔注射卵白蛋白與氫氧化鋁懸液的混合液（0.1 mg ＋0.1 mL）進行初次免疫，第10 天進行第2次免疫［5］，以建立慢性蕁麻疹小鼠模型。

給藥:臨用前，取C1組、C2組、C3組各劑量生藥，按常規(guī)方法分別制備銀連祛風湯，并定容至1 200 mL，備用；取地氯雷他定分散片10 片（50 mg），溶于1 200 mL水，備用。C1組、C2組、C3組、D 組小鼠在初次免疫后的第6 天開始灌胃給藥，每天上午10:00 按0.02 mL/g小鼠體質(zhì)量灌胃1 次，A 組和B 組小鼠灌胃等體積生理鹽水。各組小鼠均連續(xù)灌胃21 d。

小鼠軀體情況觀察:于第1 次和第2 次免疫后的第2 天，分別觀察各組小鼠精神狀態(tài)、呼吸、皮毛、飲食、大小便、有無抓撓等情況。

血清和血管壁組織勻漿上清液中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD4＋和CD8＋細胞陽性率檢測:末次給藥的第2 天，腹腔注射5 mL/kg 20%烏拉坦麻醉小鼠，每只小鼠分別經(jīng)眼球摘除取血1 mL，離心（1 500 r/min）30 min，取血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｃ擃i處死小鼠后，分別剝?nèi)∶恐恍∈笱鼙诮M織0.5 g，加2 mL 不含鈣、鎂的磷酸鹽（PBS）緩沖液，得血管壁組織勻漿，離心（3 000 r/min）30 min，取上清液，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩２捎秒p抗體酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清及血管壁組織勻漿上清液中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平，采用流式細胞儀檢測CD4＋和CD8＋細胞陽性率，嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以X±s 表示，行單因素方差分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠軀體情況

第1 次免疫后，除個別小鼠出現(xiàn)異常行為外，其余小鼠均活動自如，未出現(xiàn)明顯異常表現(xiàn)。第2 次免疫后，B 組、C1組、C2組、C3組、D 組小鼠均出現(xiàn)不同程度抓撓、煩躁不安、易驚、皮毛光澤度變差等陽性反應；各組小鼠飲食均正常，C1組、C2組、C3組小鼠大便褐黑色；A組小鼠基本無上述反應。詳見表1。

表1 第2 次免疫后各組小鼠軀體情況（n ＝12）Tab.1 Body condition of mice in each group after the second immunization（n ＝12）

2.2 對小鼠血清中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD4＋和CD8＋細胞陽性率的影響

與A 組比較，B 組小鼠MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細胞陽性率均明顯升高，CD4＋細胞陽性率、CD4＋/CD8＋比值均明顯降低（P ＜0.01）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組、D 組小鼠MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平均明顯降低，C3組和D 組小鼠CD4＋細胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值均明顯升高（P ＜0.05）；與C1組比較，C3組和D 組小鼠上述指標變化顯著（P ＜0.05）。詳見表2 和表3。

表2 銀連祛風湯對小鼠血清中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平的影響（± s，pg/mL，n ＝12）Tab.2 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on MCP-1，Eotaxin and IL-4 levels in serum of mice（± s，pg/mL，n ＝12）

表2 銀連祛風湯對小鼠血清中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平的影響（± s，pg/mL，n ＝12）Tab.2 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on MCP-1，Eotaxin and IL-4 levels in serum of mice（± s，pg/mL，n ＝12）

注:與A 組比較，*P ＜0.01；與B 組比較，△P ＜0.05；與C1組比較，▲P ＜0.05。下表同。Note:Compared with those in group A，* P ＜0.01；compared with those in group B，△P ＜0.05；compared with those in group C1，▲P ＜0.05；as well as the following tables.

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量0 0 18.35 g/（kg·d）36.70 g/（kg·d）55.05 g/（kg·d）0.83 mg/（kg·d）MCP-1 156.34±17.62 423.65±45.39*386.61±39.22△311.28±28.46△▲187.33±21.56△▲198.45±24.13△▲Eotaxin 38.19±4.39 86.47±10.37*74.91±10.26△63.89±8.58△▲45.93±6.77△▲46.54±6.32△▲IL-4 27.65±3.78 45.36±4.37*41.41±4.02△36.27±3.39△▲30.52±3.65△▲31.27±3.82△▲

表3 銀連祛風湯對小鼠血清中CD4＋，CD8＋細胞陽性率的影響（± s，n ＝12）Tab.3 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the positive rate of CD4＋ and CD8＋ cells in serum of mice（± s，n ＝12）

表3 銀連祛風湯對小鼠血清中CD4＋，CD8＋細胞陽性率的影響（± s，n ＝12）Tab.3 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the positive rate of CD4＋ and CD8＋ cells in serum of mice（± s，n ＝12）

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量0 0 18.35 g/（kg·d）36.70 g/（kg·d）55.05 g/（kg·d）0.83 mg/（kg·d）CD4＋（%）40.19±3.63 30.73±2.93*33.31±3.04△36.97±3.31△▲38.93±3.39△▲37.54±3.32△▲CD8＋（%）24.27±2.37 29.47±2.86*28.42±2.73 26.52±2.69△25.89±2.38△▲26.13±2.49△▲CD4＋/CD8＋1.69±0.46 1.04±0.21*1.12±0.26 1.37±0.33△▲1.54±0.43△▲1.47±0.42△▲

2.3 對小鼠血管壁組織勻漿上清液中MCP-1，IL-4，Eotaxin 水平及CD4＋和CD8＋細胞陽性率的影響

與A 組比較，B 組小鼠MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細胞陽性率均明顯升高，CD4＋細胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值均明顯降低（P ＜0.01）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組、D 組小鼠MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平均明顯降低，C3組和D 組小鼠CD4＋細胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值均明顯升高（P ＜0.05）；C1組比較，C3組小鼠上述指標變化顯著（ P ＜0.05）。詳見表4 和表5。

表4 銀連祛風湯對小鼠血管壁組織勻漿上清液中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平的影響（± s，pg/mL，n ＝12）Tab.4 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the levels of MCP-1，Eotaxin and IL-4 in the supernatant of blood wall tissue homogenate of mice（± s，pg/mL，n ＝12）

表4 銀連祛風湯對小鼠血管壁組織勻漿上清液中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平的影響（± s，pg/mL，n ＝12）Tab.4 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the levels of MCP-1，Eotaxin and IL-4 in the supernatant of blood wall tissue homogenate of mice（± s，pg/mL，n ＝12）

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量0 0 18.35 g/（kg·d）36.70 g/（kg·d）55.05 g/（kg·d）0.83 mg/（kg·d）MCP-1 154.76±15.78 410.55±43.28*367.51±31.12△287.43±23.21△▲158.79±16.28△▲179.41±19.52△▲Eotaxin 37.44±4.14 79.66±9.25*71.33±8.42△55.36±6.04△▲38.68±4.51△▲41.22±4.27△▲IL-4 25.47±3.59 43.86±4.48*41.27±3.96△35.07±3.65△▲27.14±3.47△▲28.66±3.75△▲

3 討論

卵白蛋白＋氫氧化鋁的混懸液制備慢性蕁麻疹小鼠模型重復性好，方法簡單［6-7］。本研究中，模型組及各用藥組小鼠首次免疫后，基本未出現(xiàn)明顯異常表現(xiàn)。第2 次免疫后，模型組及各用藥組小鼠出現(xiàn)不同程度抓撓、煩躁不安、易驚、皮毛光澤度變差等陽性反應。類似于人體變態(tài)反應性疾病的主要臨床癥狀，符合蕁麻疹動物模型基本特征，提示造模成功。

研究表明，多種炎性細胞因子共同參與慢性蕁麻疹發(fā)病的免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡［3，8］，其中，輔助性T 淋巴細胞Th1和Th2的活性失衡是誘發(fā)慢性蕁麻疹等變態(tài)反應性疾病的主要原因。Th1細胞與Th2細胞通過自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)平衡。自分泌調(diào)節(jié)已被多種試驗證實［9-10］，旁分泌機制研究尚不成熟。慢性蕁麻疹患者Eotaxin 和MCP-1 水平的表達均顯著升高［11-12］。MCP-1 可有效促進Th2細胞分泌細胞因子IL-4［2］。Eotaxin 對嗜酸粒細胞具有特異趨化作用，通過調(diào)節(jié)嗜酸粒細胞并釋放IL-4 等Th2細胞因子，使其大量聚集在炎性部位［13-14］，導致Th1/Th2明顯失衡，從而引發(fā)慢性蕁麻疹等過敏性疾病。可見，MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平在慢性蕁麻疹中的表達會同步升高，這是一種正性調(diào)節(jié)關系。本研究中，用銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹模型小鼠，其血清及血管壁組織勻漿上清液中MCP-1 和Eotaxin 水平均降低，IL-4 水平隨之降低，與上述理論吻合。由于IL-4 等Th2類細胞因子在誘發(fā)慢性蕁麻疹等過敏反應性疾病中起決定性作用［15］，當IL-4 水平異常升高時，機體免疫出現(xiàn)向Th2方向漂移的傾向［16］，慢性蕁麻疹患者體內(nèi)Th1/Th2處于失衡狀態(tài)。本研究中使用銀連祛風湯后，IL-4 表達水平顯著下降，推測漂移現(xiàn)象隨之減弱。提示銀連祛風湯可發(fā)揮治療慢性蕁麻疹的作用，同時糾正Th1和Th2失衡狀態(tài)。

表5 銀連祛風湯對小鼠血管壁組織勻漿上清液中CD4＋和CD8＋細胞陽性率的影響（± s，n ＝12）Tab.5 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the positive rate of CD4＋ and CD8＋ cells in the supernatant of blood wall tissue homogenate of mice（± s，n ＝12）

表5 銀連祛風湯對小鼠血管壁組織勻漿上清液中CD4＋和CD8＋細胞陽性率的影響（± s，n ＝12）Tab.5 Effect of Yinlian Qufeng Decoction on the positive rate of CD4＋ and CD8＋ cells in the supernatant of blood wall tissue homogenate of mice（± s，n ＝12）

組別A 組B 組C1 組C2 組C3 組D 組劑量0 0 18.35 g/（kg·d）36.70 g/（kg·d）55.05 g/（kg·d）0.83 mg/（kg·d）CD4＋（%）36.25±4.34 29.15±3.13*32.03±3.11△34.77±4.12△35.15±4.28△▲34.43±4.02△CD8＋（%）22.41±2.46 27.74±2.67*25.66±2.53 24.71±2.42△22.69±2.16△▲24.07±2.46△CD4＋/CD8＋1.55±0.42 1.03±0.19*1.22±0.25△1.41±0.35△1.53±0.41△▲1.44±0.39△

慢性蕁麻疹與T 淋巴細胞聯(lián)系緊密［17］，CD4＋和CD8＋細胞陽性率是成熟階段T 淋巴細胞的重要特征指標。慢性蕁麻疹細胞免疫主要表現(xiàn)在血清輔助淋巴細胞CD4＋表達水平下調(diào)，細胞毒性T 細胞CD8＋表達水平上調(diào)，導致CD4＋/CD8＋比值同步下降［18］。研究發(fā)現(xiàn)，慢性蕁麻疹患者體內(nèi)CD4＋和CD8＋細胞比例失調(diào)，CD4＋/CD8＋比值降低［19-20］。本研究中，治療后小鼠血清及血管壁組織勻漿上清液中CD8＋細胞陽性率明顯降低，CD4＋細胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值均升高。

慢性蕁麻疹模型小鼠血管壁組織勻漿上清液中的MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD4＋，CD8＋細胞陽性率的改善程度要優(yōu)于血清的改善程度。可能是慢性蕁麻疹發(fā)病時血管通透性增加，表皮出現(xiàn)紅斑、水腫等蕁麻疹病變。治療后，血管通透性隨之降低，聚集在血管壁組織勻漿中的MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細胞陽性率明顯下降甚至消除，CD4＋細胞陽性率代償性升高，并彌補其功能上的不足。外周血由于全身循環(huán)，異常因子的徹底改善會相對慢一些，出現(xiàn)了時間窗，類似人類慢性蕁麻疹皮損已消除，但如不鞏固治療會反復發(fā)作。

本研究結(jié)果顯示，B 組小鼠血清及血管壁勻漿組織上清液中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細胞陽性率均明顯高于A 組，CD4＋細胞陽性率明顯低于A 組。治療后，外周血及血管壁組織中上述因子的表達水平均明顯改善，且血管壁組織中的改善程度優(yōu)于外周血清。而C3組的指標值接近正常值；C3組、C2組的改善程度優(yōu)于C1組。三者量效依賴關系良好。銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹的作用可能是通過降低外周血及血管壁組織中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細胞陽性率，升高CD4＋細胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值而實現(xiàn)的，提示MCP-1，Eotaxin，IL-4，CD4＋，CD8＋參與了慢性蕁麻疹的發(fā)生、發(fā)展過程。

中醫(yī)學將慢性蕁麻疹歸為“癮疹”范疇［21］，發(fā)病機制為風寒夾濕，汗出當風，內(nèi)生風邪，致濕熱蘊結(jié)，陰虛血燥，濕邪化熱［22-23］。地氯雷他定是第二代抗組胺藥，治療慢性蕁麻疹療效確切，但復發(fā)率高。銀連祛風湯處方中銀花、土茯苓清熱除濕，生地、丹皮涼血養(yǎng)陰，為君藥，四藥合用共奏清熱涼血消風之功；連翹、石膏清熱瀉火，為臣藥；白蒺藜與地膚子清熱疏風止癢；茵陳清熱利濕；炒僵蠶祛風止痛；地骨皮清肺降火；生甘皮理氣降逆。全方配伍合理，共奏祛風清熱、涼血消風、潤燥通里之功。因此，銀連祛風湯能從病因?qū)W上抑制慢性蕁麻疹的炎性反應，使外周血及血管壁組織中MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋細胞陽性率明顯下降，CD4＋細胞陽性率和CD4＋/CD8＋比值明顯升高，可有效改善毛細血管通透性增加等病理損傷，發(fā)揮治療慢性蕁麻疹的作用。

綜上所述，銀連祛風湯能顯著降低慢性蕁麻疹模型小鼠MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平和CD8＋細胞陽性率，升高CD4＋細胞陽性率。但銀連祛風湯調(diào)節(jié)慢性蕁麻疹患者體內(nèi)MCP-1，Eotaxin，IL-4 水平及CD8＋，CD4＋細胞陽性率的具體作用通路及相關靶點仍需進一步研究。