離子色譜-脈沖安培檢測法測定洋常春藤游離糖成分含量

史萬忠，欒紹齋，倪力軍

（1. 上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 201203； 2. 中國人民解放軍71239 部隊93 分隊，遼寧 營口115002； 3. 華東理工大學化學與分子工程學院，上海 200237）

常春藤為五加科常綠藥用和觀賞植物，《歐洲藥典》將洋常春藤Hedera helix L. 收錄為藥用植物［1］。洋常春藤提取物作為一種傳統的祛痰藥物，其提取溶劑一般為30% ～70%乙醇，常用劑型有片劑、膠囊、泡騰片、口服液、糖漿劑，已在歐洲多個國家獲批上市［2］。洋常春藤中主要藥用生物活性化合物為三萜皂苷，以及其他化合物如黃酮類、香豆素類、揮發油、維生素、糖類等。目前，對洋常春藤中三萜皂苷、黃酮苷類、苯丙素類化學成分的研究較多，但尚無研究糖類成分的報道［3-7］。離子色譜法利用被測物質的離子性進行分離和檢測，能有效分析所有游離糖成分，檢測速度快，無需衍生化。陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法分離能力強，靈敏度高，在糖及相關化合物的分析中有獨特優勢［8-12］，本研究中采用此方法測定不同產地洋常春藤游離糖的含量，并優化離子色譜條件，為后續藥用部位和藥用成分的研究提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ThermofisherICS-6000 型離子色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），配置有脈沖安培檢測器（工作電極為金電極）；ML104/02 型電子分析天平（精度為0.1 mg），XSE105DU 型電子天平（精度為0.01 mg），均購于梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司；DS-3510 DTH 型超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司，功率為180 W，頻率為40 kHz）；有機相針式濾器（上海安譜科學儀器有限公司）；FW177 型中藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；UPK-I-10T 型去離子水機（四川優普超純科技有限公司）。

1.2 試藥

D-葡萄糖醛酸（批號為140648-201804，純度為99.8% ），D-核糖（批號為140668-201302，純度為99.6% ），海藻糖（批號為190073-201501，純度為99.7%），D-無水葡萄糖（批號為110833-201707，純度為99.9%），D-果糖（批號為111504-201703，純度為99.8%），阿拉伯糖（批號為111506-200202，純度為99.5% ），蔗糖（批號為111507-201704，純度為100.0% ），乳糖（批號為100058-201605，純度為94.8% ），半乳糖（批號為100226-201506，純度為100.0%），D-木糖（批號為111508-201605，純度為99.9%），D-半乳糖醛酸（批號為111646-201702，純度為95.1%），鼠李糖（批號為111683-201502，純度為98.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；On Guard RP 前處理柱（上海安譜實驗科技股份有限公司）；氫氧化鈉、醋酸鈉均為優級純（德國Merck 公司）；試驗用水為自制去離子水。試驗中所用11 批次洋常春藤藥材分別采集于山東、上海、廣東、江蘇。經中國中醫科學院中藥研究所陳士林教授鑒定為正品。采集藥材的信息見表1。

表1 洋常春藤藥材信息Tab.1 Information of Hedera helix

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:ThermoDionexCarboPacPA1 分析柱（250mm×4 mm），Thermo DionexCarboPac PA1 保護柱（50 mm ×4 mm）；檢測器:四電位脈沖安培檢測器，AS -AP 自動進樣器；流動相:超純水（A）-50 mmol/ L NaOH 和1 mol/L NaAc 溶液（B）-100 mmol/L NaOH 溶液（C），梯度洗脫程序見表2；柱溫:25 ℃；流速:1.0 mL/min；進樣量:10 μL。

表2 離子色譜流動相梯度洗脫程序（%）Tab.2 Gradient elution program of ion chromatography（%）

2.2 溶液制備

混合對照品溶液:取海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、D-無水葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-核糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸對照品適量，精密稱定，加超純水制成每1 mL 含海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、D-無水葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-核糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸分別為1.237，1.159，1.012，1.707，1.285，1.397，1.225，1.267，1.270，1.430，1.201，1.202 mg 的對照品貯備液。取對照品貯備液適量，加超純水制成每1 mL 含海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、D-無水葡萄糖、D-木糖、D-果糖，D-核糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸分別為49.48，46.36，40.48，68.28，51.40，55.88，49.00，50.68，50.80，57.20，48.04，48.08 μg 的混合對照品溶液，搖勻，采用0.22 μm水系過濾膜濾過，即得。

供試品溶液:取樣品粉末（過40 目篩）0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加去離子水50 mL，加熱回流3 h，減壓回收溶劑，殘渣用去離子水溶解，轉移至50 mL 容量瓶中，加去離子水至刻度，搖勻，采用0.22 μm 水系過濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

專屬性試驗:不加洋常春藤樣品，直接加入去離子水，按供試品溶液制備方法制備空白溶液，按2.1 項下色譜條件進樣檢測。結果未發現干擾洋常春藤游離糖成分的色譜峰。離子色譜圖見圖1。

1. 海藻糖 2. 鼠李糖 3. 阿拉伯糖 4. 半乳糖 5. D-葡萄糖 6. D-木糖 7. D-果糖 8. D-核糖 9. 蔗糖10. 乳糖 11. D-半乳糖醛酸 12. D-葡萄糖醛酸A. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液 C. 空白溶液圖1 專屬性試驗離子色譜圖1.trehalose 2. rhamnose 3.arabinose 4. galactose 5. D-glucose 6. D-xylose 7. D-fructose 8. D-ribose 9.sucrose 10.lactose 11. D-galacturonic acid 12. D-glucuronic acidA.Mixed reference solution B.Test solution C.Blank solutionFig.1 Ion chromatograms for specificity test

線性關系考察:取2.2 項下混合對照品溶液，依次稀釋0，2，2.5，5，10 倍，配制成系列質量濃度梯度的混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件，精密吸取10 μL，注入離子色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積積分值（Y）為縱坐標、對照品質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線。結果見表3。

表3 各被測成分線性關系考察結果（n ＝5）Tab.3 The linear relationship of each component（n ＝5）

精密度試驗:精密吸取2.2 項下混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件連續進樣6 次，測定。結果海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、D-無水葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-核糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖醛酸峰面積的RSD 分別為2.66% ，2.81% ，2.12% ，1.98% ，2.98% ，2.87% ，2.58% ，2.68% ，2.61%，2.86%，1.64%，1.36%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取樣品（批號JS160731-1 葉），按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別進樣6 次。結果阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-果糖、蔗 糖 峰 面 積 的 RSD 分 別 為2.12% ，2.98% ，2.58%，2.61%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:取同一批（批號JS160731-1 葉）樣品6 份，每份0.25 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入對照品貯備液（阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-果糖和蔗糖對照品含量分別為0.607 2，1.285 0，1.102 5，3.175 0 mg）適量，依法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入離子色譜儀，按2.1 項下色譜條件進樣測定，用外標法計算回收率。結果阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-果糖、蔗糖的平均回收率分別為99.21%，97.84% ，97.32% ，96.20% ，RSD 分 別 為3.46% ，3.85% ，2.94%，3.28%（n ＝6）。

表4 11 批次洋常春藤藥材中4 種糖類成分含量測定結果（mg/g，n ＝2）Tab.4 Results of content determination of four sugars in 11 batches of Hedera helix（mg/g，n ＝2）

2.4 樣品含量測定

取11 批次洋常春藤干燥莖和葉，依法制備供試品溶液，過0.22 μm 水相濾膜，精密吸取10 μL 注入離子色譜儀，按2.1 項下色譜條件進樣測定2 次，記錄色譜圖，用外標法計算樣品含量。含量測定結果見表4，色譜圖見圖2。

1. 阿拉伯糖 2. D-無水葡萄糖 3. D-果糖 4. 蔗糖A. 莖 B 葉圖2 樣品含量測定離子色譜圖1.arabinose 2. D-glucose 3. D-fructose 4. sucroseA.Stem B.LeafFig.2 Ion chromatograms for content determination of samples

2.5 樣品含量分析

根據11 批次洋常春藤藥材中4 種游離糖成分含量測定結果，按不同藥用部位和不同產地分類匯總并計算4 種游離糖成分含量，詳見表5。可見，不同產地和部位（莖或葉）洋常春藤中的游離糖成分主要為阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-果糖和蔗糖4 種。不同部位比較顯示，莖中D-無水葡萄糖和D-果糖含量均高于葉中，莖中阿拉伯糖和蔗糖含量均低于葉中；不同產地比較顯示，上海產的阿拉伯糖含量最高，江蘇產的D-無水葡萄糖和D-果糖含量最高，廣東產的蔗糖含量最高；廣東產洋常春藤（莖＋葉）中4 種游離糖成分總含量最高，平均總含量為82.23 mg/g，蔗糖含量為67.46%，占比最高。

表5 不同產地和部位洋常春藤藥材游離糖成分含量測定結果（mg/g）Tab.5 Content of free sugar components in Hedera helix from different places of origin and different parts（mg/g）

3 討論

糖類的檢測方法主要有氣相色譜法［13-14］、高效毛細管電泳法［15-16］、高效液相色譜法［17］等。氣相色譜法要求待測物在分析條件下可氣化，且不分解；高效毛細管電泳法和高效液相色譜法均采用紫外檢測器，要求待測物有紫外吸收。由于糖類大都無足夠的揮發性，且無吸光基團，故上述3 種分析方法都需先對其進行衍生化，操作煩瑣，結果重復性差，不利于開展大批量精準檢測。雖然高效液相色譜法也可以采用示差檢測器，無需衍生化，但其靈敏度較低，且受溫度和流動相影響較大，穩定性和重復性都欠佳。

本研究中采用梯度洗脫程序，通過梯度淋洗改變流動相的pH，使各成分有效分離。糖類為pKa 在12 ～14的弱酸，其中半乳糖、果糖、木糖、葡萄糖的pKa 值分別為12.35，12.03，12.15，12.28，在高pH 淋洗液中均會部分或全部以陰離子形式存在，可在陰離子交換柱上保留并得到分離。當100 mol/L NaOH 溶液（流動相C）比例大于25%時，保留時間縮短，由于半乳糖和葡萄糖屬差相異構體和位置異構體，半乳糖和葡萄糖不能完全分離；低于15%時，半乳糖和葡萄糖可完全分離；低于25%時，核糖和蔗糖不能完全分離。試驗發現，如果初始時間段流動相C 比例過低，后續提高流動相C 比例，核糖和蔗糖仍不能完全分離。為使各成分達到分離要求，故設置初始流動相C 比例為18% ，并梯度提高至30%；糖醛酸類物質保留相對較長，醋酸根具有比氫氧根更強的淋洗能力，故提高醋酸根濃度洗脫出糖醛酸類物質。最終確定梯度洗脫條件。

本研究中比較了洋常春藤藥材供試品溶液制備中不同藥材粒徑（過10，20，40，60 目篩）、不同料液比（1 ∶50，1 ∶100，1 ∶200，m/ V）和不同加熱回流提取時間（1，2，3，4 h）的提取效果，最終確定最佳提取條件。

試驗結果顯示，洋常春藤莖和葉中均含有4 種游離糖成分（阿拉伯糖、D -無水葡萄糖、D -果糖和蔗糖）。莖和葉部位的4 種游離糖中，蔗糖和D -無水葡萄糖含量較高，其次為D -果糖，阿拉伯糖含量最低；不同產地洋常春藤中，各游離糖成分的含量有明顯差異。

綜上所述，本方法可全面評價洋常春藤中發揮作用的藥效物質及對其中有效提取部位進行質量控制，分離能力強，靈敏度高，可為后續用藥部位和藥用成分內控指標的建立提供參考。