阿莫西林膠囊溶出度測(cè)定方法研究*

沈 川，程 義，曾令高，姜學(xué)美，沈丹丹△

（1. 重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院，重慶 401420； 2. 重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121； 3. 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局麻醉精神藥品質(zhì)量監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401121）

阿莫西林膠囊可治療多種細(xì)菌感染引起的疾病，包括喉炎、肺炎、皮膚感染、泌尿道感染等［1］，目前國(guó)內(nèi)共有267 個(gè)批準(zhǔn)文號(hào)，涉及125，250，500 mg 3 個(gè)規(guī)格。國(guó)外上市的主要發(fā)達(dá)國(guó)家有英國(guó)、美國(guó)及澳大利亞，英國(guó)比切姆公司生產(chǎn)的Amoxil?Capsules 250 mg 是全球最早上市的阿莫西林膠囊，已在美國(guó)停售，目前仍在英國(guó)銷售。2015年版《中國(guó)藥典（二部）》（ChP 2015）［2］、《美國(guó)藥典（42 版）》（USP 42）［3］、《英國(guó)藥典（2020 版）》（BP 2020）［4］及《日本藥典（17 版）》（JP 17）［5］均收載有阿莫西林膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，BP 2020 未規(guī)定溶出度檢查項(xiàng)，其余各國(guó)溶出度測(cè)定方法均有差異，JP 17 采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定溶出度，ChP 2015（自身對(duì)照法）與USP 42（對(duì)照品對(duì)照法）均采用紫外-可見分光光度（UV-Vis）法。根據(jù)2017年原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《總局關(guān)于發(fā)布仿制藥參比制劑目錄（第三批）的通告》（2017年第65 號(hào)），阿莫西林膠囊（規(guī)格為每粒按C16H19N3O5S 計(jì)0.25 g）的原研參比制劑為Beecham Group plc 的Amoxil?。本品所用明膠膠囊殼中含有多種色素著色劑，均未在中國(guó)、美國(guó)及日本上市，且各國(guó)上市的仿制品膠囊配色方案均各不相同。本研究中分別采用UV-Vis 法及HPLC 法測(cè)定原研產(chǎn)品在水、pH 1.2 的鹽酸氯化鈉溶液、pH 4.0 的醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液4 種溶出介質(zhì)中的溶出曲線，擬建立一種更加準(zhǔn)確的阿莫西林溶出度測(cè)定方法，更加真實(shí)地反映阿莫西林膠囊的體外溶出度，為藥物一致性評(píng)價(jià)過程中處方工藝優(yōu)化提供借鑒。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀，包括Waters 2489型紫外檢測(cè)器、Waters 色譜工作站（美國(guó)Waters 公司）；AT Xtend 型溶出度儀（瑞士Sotax 公司）；XP205 型電子天平（梅特勒-托利多公司，精度為十萬分之一）；UV-2401型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津制作所）。

1.2 試藥

阿莫西林對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為130409-201011，含量為86.9%）；阿莫西林膠囊（商品名Amoxil?，批號(hào)為136，規(guī)格為每粒0.25 g）；磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、醋酸鈉三水合物、氯化鈉、無水磷酸氫二鈉、鹽酸、醋酸均為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

取樣品，按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》溶出度與釋放度測(cè)定法（通則0931 第一法）［6］，分別以水、pH 1.2的鹽酸氯化鈉溶液、pH 4.0 的醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液900 mL 為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r/min，依法測(cè)定，分別于5，10，15，30，45，60，90，120 min 時(shí)取10.0 mL，及時(shí)補(bǔ)充相同溫度、相同體積的溶出介質(zhì)，作為貯備溶液。

2.2 溶出度定量測(cè)定

2.2.1 UV-Vis 法

取2.1 項(xiàng)下溶液適量，用0.45 μm 混合纖維素酯濾膜濾過，棄去3 mL 初濾液，精密量取續(xù)濾液適量，用溶出介質(zhì)定量稀釋成每1 mL 中含阿莫西林（按C16H19N3O5S 計(jì)）130 μg 的溶液，作為供試品溶液。另取阿莫西林對(duì)照品適量，精密稱定，用溶出介質(zhì)溶解并定量稀釋成每1 mL 中含阿莫西林（按C16H19N3O5S 計(jì)）130 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0401 UV-Vis 法，于272 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算各取樣時(shí)間點(diǎn)溶出度，并繪制溶出曲線。結(jié)果見表1 和圖1。可見，參比制劑在4 種溶出介質(zhì)中的溶出度均達(dá)110%。原研膠囊殼成分包括明膠（囊材）、赤蘚紅（色素）、二氧化鈦（遮光劑）、靛藍(lán)（色素）、氧化鐵黃（色素）和紫膠（色素），其色素可能干擾紫外測(cè)定，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。

表1 UV-Vis 法測(cè)定阿莫西林膠囊參比制劑在不同溶出介質(zhì)中各取樣時(shí)間點(diǎn)的溶出度（%）Tab.1 Determination of dissolution of Amoxicillin Capsules reference preparation in different dissolution medium at different sampling time points by UV-Vis method（%）

圖1 阿莫西林膠囊參比制劑在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線（UV-Vis 法）Fig.1 The dissolution profiles of Amoxicillin Capsules reference preparation in different dissolution medium （UV-Vis method）

2.2.2 HPLC 法

溶液制備:以水、pH 4.0 的醋酸鹽緩沖液、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，取2.1 項(xiàng)下溶液適量，用0.45 μm 混合纖維素酯濾膜濾過，棄去3 mL 初濾液，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；以pH 1.2 的鹽酸氯化鈉溶液為溶出介質(zhì)，取續(xù)濾液5.0 mL，置25 mL 容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液（pH 6.8 磷酸鹽緩沖液與水按1 ∶1 混合）稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。以水、pH 4.0 的醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，取阿莫西林對(duì)照品適量，精密稱定，用3 種溶出介質(zhì)溶解，并定量稀釋成每1 mL 含阿莫西林（按C16H19N3O5S 計(jì)）278 μg 的溶液，作為對(duì)照品溶液；以pH 1.2 的鹽酸氯化鈉溶液為溶出介質(zhì)，精密量取溶液5.0 mL，置25 mL 容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液。

色譜條件:色譜柱為Inertsil ODS C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（用2 mol/L 氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 至5.0）-乙腈（97.5 ∶2.5，V/ V）；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL。

溶出度測(cè)定:取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算各取樣時(shí)間點(diǎn)的溶出度，并繪制溶出曲線。結(jié)果見表2 和圖2。結(jié)果阿莫西林膠囊在水、pH 4.0 的醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液中溶出度均達(dá)100.00%，在pH 1.2 的鹽酸氯化鈉溶液中溶出10 min 后達(dá)到最大溶出度，隨著時(shí)間的推移，溶出度呈下降趨勢(shì)，這主要是由于阿莫西林在pH 1.2的鹽酸氯化鈉溶液中不穩(wěn)定。且供試品溶液中均未檢出阿莫西林，表明空膠囊殼中未能檢出殘留的阿莫西林，空膠囊殼中殘留的阿莫西林不干擾參比制劑膠囊殼溶出度的測(cè)定結(jié)果。

表2 HPLC 法測(cè)定阿莫西林膠囊參比制劑在不同溶出介質(zhì)中各取樣時(shí)間點(diǎn)的溶出度（%）Tab.2 Determination of dissolution of Amoxicillin Capsules reference preparation in different dissolution medium at different sampling time points by HPLC method（%）

圖2 阿莫西林膠囊參比制劑在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線（HPLC 法）Fig.2 The dissolution profiles of Amoxicillin Capsules reference preparation in different dissolution medium （HPLC method）

2.3 膠囊殼溶出干擾試驗(yàn)

取原研參比制劑，傾出內(nèi)容物，將膠囊殼用壓縮空氣吹干凈。取空膠囊殼，以水900 mL 為溶出介質(zhì)，按2.1 項(xiàng)下方法配制供試品溶液。取溶液適量，分別按2.2.1 及2.2.2 項(xiàng)下方法操作，計(jì)算膠囊殼干擾值。結(jié)果見表3。可見，原研制劑的空膠囊對(duì)紫外測(cè)定方法有干擾，不能采用UV-Vis 法測(cè)定累積溶出量，故選擇HPLC 法測(cè)定。

表3 UV-Vis 法測(cè)定參比制劑膠囊殼平均累積溶出干擾率（%）Tab.3 Determination of interference rate of average cumulative dissolution of capsule shell of reference preparation by UV-Vis method（%）

2.4 自制樣品與參比制劑溶出曲線比較

取樣品，按2.1 項(xiàng)下方法操作，取溶液適量，按2.2.2 項(xiàng)下方法操作，精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算各取樣時(shí)間點(diǎn)的溶出度，并繪制溶出曲線。結(jié)果見表4 和圖3。計(jì)算差異因子（ f1）與相似因子（ f2）。結(jié)合圖2 參比制劑溶出曲線，在pH 1.2 的鹽酸氯化鈉溶液中均能在15 min 內(nèi)溶出85%以上，隨著時(shí)間的推移，溶出度均呈下降趨勢(shì)。在這種情況下，藥物吸收的限速步驟是胃排空。在禁食狀態(tài)下，胃排空50%所需的平均時(shí)間為15 ～20 min。因此，如果藥物在溫和溶出試驗(yàn)條件下，15 min 內(nèi)在0.1 mol/L 的鹽酸溶液中溶出85%，類似于溶液，通常應(yīng)無任何生物利用度問題。按照普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則［7］，受試制劑與參比制劑的溶出曲線f1值和f2值的比較和計(jì)算應(yīng)滿足以下2 個(gè)條件:1）受試制劑與參比制劑應(yīng)在完全相同的條件下測(cè)定溶出曲線，且2 條曲線的取樣點(diǎn)應(yīng)相同；2）藥物溶出度超過85%的取樣點(diǎn)不超過1 個(gè)。故本研究中選取了在水、pH 4.0 的醋酸鹽緩沖液和pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液中5，10，15，30，45，60 min 的取樣點(diǎn)計(jì)算f1值和f2值，自制樣品與參比制劑溶出度數(shù)據(jù)的f2值分別為67.04，72.59，63.50，均大于50，f1值分別為7.74，5.63，6.58，均小于10，符合美國(guó)食品藥物管理局（FDA）《口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》及日本厚生勞動(dòng)省醫(yī)藥品食品衛(wèi)生管理局《仿制藥生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》對(duì)于溶出曲線相似性的判定標(biāo)準(zhǔn)，提示自制樣品與參比制劑具有相似的溶出行為。

表4 HPLC 法測(cè)定自制樣品在不同溶出介質(zhì)中各取樣時(shí)間點(diǎn)的溶出度（%）Tab.4 Determination of dissolution of self-made products in different dissolution medium at different sampling time points by HPLC method（%）

圖3 自制樣品在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線（HPLC 法）Fig.3 The dissolution profiles of self-made products in different dissolution medium （HPLC method）

3 討論

3.1 UV-Vis 法與HPLC 法的溶出曲線差異比較

本研究中采用USP 40 UV-Vis 對(duì)照品對(duì)照法及ChP 2015 二部阿莫西林膠囊含量測(cè)定HPLC 法分別測(cè)定阿莫西林膠囊在4 種溶出介質(zhì)中的溶出度并繪制溶出曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用UV -Vis 法測(cè)定的累積溶出量均達(dá)到110%，測(cè)定結(jié)果偏高，但采用HPLC 法測(cè)定阿莫西林膠囊在水、pH 4.0 的醋酸鹽緩沖液、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中的溶出度均在100% 左右，與UV-Vis 對(duì)照品法測(cè)定結(jié)果比較，HPLC 法測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。比較UV-Vis 法與HPLC 法測(cè)定溶出曲線的差異，可能主要由以下原因引起:1）膠囊殼干擾UV-Vis測(cè)定。Amoxil?所用明膠膠囊殼中含有多種色素著色劑（赤蘚紅、靛藍(lán)、氧化鐵黃和紫膠），在紫外光測(cè)定條件下存在干擾。而本品未在中國(guó)、美國(guó)及日本上市，且各國(guó)上市的仿制品膠囊的配色方案又各不相同，不同色素在272 nm 波長(zhǎng)處的吸收值也各不相同，故對(duì)于UV-Vis法的測(cè)定存在不同程度的干擾或毫無干擾。2）雜質(zhì)干擾UV -Vis 法測(cè)定。根據(jù)USP 42 收載的阿莫西林原料雜質(zhì)譜，阿莫西林共有11 個(gè)已知雜質(zhì)，各雜質(zhì)在272 nm 波長(zhǎng)處可能有一定吸收，從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。3）每次溶出曲線測(cè)定的誤差及膠囊裝量差異。

本研究中，膠囊殼溶出干擾試驗(yàn)結(jié)果，Amoxil?膠囊殼在0，5，10，15，30，45，60，90，120 min 時(shí)的干擾值均接近5%，隨著時(shí)間的推移，膠囊干擾率呈增加趨勢(shì)，表明膠囊殼也是一個(gè)溶出過程。雖然《中國(guó)藥典（四部）》［6］建議空膠囊的干擾低于2%時(shí)可忽略，干擾較大時(shí)可采用空白膠囊校正法測(cè)定。但在測(cè)定溶出曲線時(shí)，不同時(shí)間點(diǎn)的膠囊干擾值是不同的，因此無法統(tǒng)一扣除膠囊的干擾，而且各企業(yè)產(chǎn)品的膠囊著色劑也不同，因此無法建立統(tǒng)一的校正方案。

3.2 HPLC 法定量測(cè)定

本研究中采用了阿莫西林膠囊溶出度HPLC 法定量測(cè)定方法，對(duì)4 種溶出介質(zhì)均進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。由于阿莫西林在酸性條件下不穩(wěn)定，因此對(duì)以pH 1.2 的鹽酸氯化鈉溶液作為介質(zhì)的供試品溶液進(jìn)行了處理。試驗(yàn)時(shí)立即取續(xù)濾液5.0 mL，置25 mL 容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，測(cè)得此溶液pH 在6.0 ～7.0，溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，此溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定。HPLC法測(cè)得阿莫西林膠囊在pH 1.2 的鹽酸氯化鈉溶液中溶出10 min 后達(dá)到最大溶出度，隨著時(shí)間的推移，溶出度呈下降趨勢(shì)，在120 min 時(shí)僅為77.11%，溶出曲線與日本橙皮書中收載的阿莫西林顆粒在pH 1.2的鹽酸氯化鈉溶液中溶出曲線趨勢(shì)基本一致［8-9］，表明阿莫西林膠囊對(duì)酸不穩(wěn)定，在試驗(yàn)過程中不斷降解。而UV-Vis 對(duì)照品法測(cè)定的溶出曲線開始呈上升趨勢(shì)，達(dá)到平衡后趨于穩(wěn)定，在120 min 時(shí)溶出度為115.64%，進(jìn)一步表明采用HPLC 法測(cè)定可消除降解雜質(zhì)的干擾，測(cè)定結(jié)果更真實(shí)、準(zhǔn)確。

3.3 研究?jī)r(jià)值

UV -Vis 法及HPLC 法測(cè)定阿莫西林膠囊在4 種溶出介質(zhì)中的溶出度并繪制的溶出曲線結(jié)果差異較大，UV -Vis 法定量測(cè)定中，膠囊及雜質(zhì)均可干擾阿莫西林膠囊的溶出度，表明本研究中建立的HPLC法更加準(zhǔn)確、真實(shí)，更能準(zhǔn)確地反映原研產(chǎn)品在4 種溶出介質(zhì)中的溶出度，可用于阿莫西林膠囊溶出曲線的比較，對(duì)一致性評(píng)價(jià)中的溶出度測(cè)定具有重要指導(dǎo)意義。