清熱止痢合劑質(zhì)量標準提升研究

董臣林，姜 迪，李拓新，肖 薇

（1. 北京市臨床藥學研究所，北京 100035； 2. 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010）

清熱止痢合劑為首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由白頭翁、地榆、兒茶、關(guān)黃柏、黃連、黃芩、葛根、白芍等多味中藥組方，具有清熱解毒、涼血止痢功效，臨床用于濕熱毒邪積滯腸腑證，癥見腹痛、腹瀉、肛門灼熱、身熱、口苦口黏。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對制劑中的白頭翁、兒茶、關(guān)黃柏、黃連、黃芩進行定性鑒別［1-3］，采用高效液相色譜（HPLC）法測定沒食子酸、葛根素、芍藥苷、黃芩苷的含量，為其質(zhì)量控制提供參考［4-12］。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

L-2000 型高效液相色譜儀，包括L-2455 DAD 型檢測器、L-2200 Cooling Unit 型自動進樣器、L-2130型四元泵（株式會社日立制作所）；CPA225D 型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，精度十萬分之一）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；KQ2200DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；JY02S 型紫外分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；BGZ-140 型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試藥

白頭翁對照藥材（批號為121615-201603），兒茶對照藥材（批號為121397-201502），鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-201212，純度為86.7%），黃芩素對照品（批號為11595-201607，純度為98.5%），漢黃芩素對照品（批號為111514-201304，純度為93.3%），沒食子酸對照品（批號為110831-201605，純度為90.8%），葛根素對照品（批號為110752-201313，純度為98.5%），芍藥苷對照品（批號為110736-201337，純度為94.9%），黃芩苷對照品（批號為110715-201318，純度為98.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；清熱止痢合劑（北京市臨床藥學研究所，批號分別為201912007，201912008，201912010）；甲醇、乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；乙酸、甲酸、硫酸、甲苯（分析純，北京市通廣精細化工公司）；乙醇、乙酸乙酯、異丙醇、正丁醇、乙醚（分析純，北京化工廠）；純化水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

白頭翁:取樣品10 mL，加甲醇10 mL，超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz）10 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取白頭翁對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》TLC 法（附錄ⅥB）試驗，吸取上述2 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-醋酸-水（4 ∶1 ∶2，V/ V/ V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點。詳見圖1 A。

1. 對照藥材溶液 2，2′. 對照品溶液 3 -5. 供試品溶液A. 白頭翁 B. 兒茶 C. 關(guān)黃柏、黃連 D. 黃芩圖1 薄層色譜圖1.reference material solution 2，2′.reference solution 3 -5.test solutionA. Radix Pulsatillae B. Acacia catechu C. Cortex Phellodendri and Rhizoma Coptidis D. Radix ScutellariaeFig.1 TLC chromatograms

兒茶:取樣品10 mL，加乙醚30 mL，超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz）10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取兒茶對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》TLC 法（附錄ⅥB）試驗，吸取上述2 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-醋酸-水（3 ∶2 ∶1，V/ V/ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點。詳見圖1 B。

關(guān)黃柏、黃連:取樣品10 mL，蒸干，加甲醇25 mL，超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz）30 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》TLC 法（附錄ⅥB）試驗，吸取上述2 種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3 ∶3.5 ∶1 ∶1.5 ∶0.5 ∶1，V/ V/ V/ V/ V/ V）為展開劑，置濃氨試液預飽和15 min 的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點。詳見圖1 C。

黃芩:取樣品10 mL，加乙酸乙酯-甲醇（3 ∶1，V/ V）的混合溶液30 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 使溶解，取上清液作為供試品溶液。取黃芩素對照品、漢黃芩素對照品，分別加甲醇制成每1mL 含0.5mg 的溶液，作為對照品溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》TLC 法（附錄ⅥB）試驗，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10 ∶3 ∶1 ∶2，V/ V/ V/ V）為展開劑，預飽和30 min，展開，取出，晾干，噴5%三氯化鐵乙醇溶液，置日光下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點。詳見圖1 D。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:甲醇（A）-0.1% 乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～15 min 時10%A→25%A，15 ～45 min 時25%A→40%A，45 ～75 min 時40%A→55%A）；流速:1.0 mL/min；檢測波長:265 nm；柱溫:30 ℃；進樣量:10 μL。

2.2.2 溶液制備

混合對照品溶液:取沒食子酸、葛根素、芍藥苷、黃芩苷對照品適量，精密稱定，分別置5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至質(zhì)量濃度為319，483，509，259 μg/mL的對照品貯備液，精密量取上述對照品貯備液適量，加甲醇定容，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為45.57，34.50，109.07，185.00 μg/mL 的混合對照品溶液。

供試品溶液:精密量取樣品1 mL，置具塞錐形瓶中，加甲醇稀釋100 倍，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取（功率為220 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗:取2.2.2 項下各溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件測定，色譜圖見圖2。結(jié)果各成分色譜峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)大于5 000，供試品溶液色譜峰與對照品溶液色譜峰保留時間基本一致。

1. 沒食子酸 2. 葛根素 3. 芍藥苷 4. 黃芩苷A. 供試品溶液 B. 混合對照品溶液圖2 高效液相色譜圖1.gallic acid 2. puerarin 3.paeoniflorin 4.baicalinA.Test solution B.Mixed reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察:精密吸取混合對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，4.5 mL，分別置5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄各成分峰面積。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，繪制各組分標準曲線，并計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果（n ＝6）Tab.1 Linear relationship of each components（n ＝6）

檢測限與定量限確定:取混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣，記錄峰面積，當信噪比為3 ∶1 時為檢測限，當信噪比為10 ∶1 時為定量限。結(jié)果沒食子酸、葛根素、芍藥苷、黃芩苷的檢測限分別為0.060 8，0.046 0，0.727 1，1.233 3 μg/mL，定量限分別為0.182 3，0.138 0，2.181 4，3.700 0 μg/mL。

精密度試驗:精密吸取混合對照品溶液10 μL，按2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果沒食子酸、葛根素、芍藥苷、黃芩苷峰面積的RSD 分別為0.72%，1.63%，1.65%，1.62%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗:取同一批（批號為201912007）樣品6份，依法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果沒食子酸、葛根素、芍藥苷、黃芩苷含量的RSD 分別為1.17%，2.43%，2.29%，1.68%（n ＝6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗:取同一批（批號為201912007）樣品6份，依法制備供試品溶液，分別于制備后0，3，6，12，24，48 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果沒食子酸、葛根素、芍藥苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.72%，2.29%，2.82%，1.88%（n ＝6），表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗:精密量取樣品（批號為201912007）6 份，各0.5 mL，分別加入樣品中各成分含量為80%，100%，120%的混合對照品溶液適量，制備成低、中、高濃度的供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算各成分的回收率。結(jié)果見表2。

2.2.4 樣品含量測定

取3 批（批 號 分 別 為201912007，201912008，201912010）樣品，分別制備供試品溶液，各批次平行制備3 份，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，計算各成分含量。結(jié)果見表3。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝6）Tab.2 Results of recovery tests（n ＝6）

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/mL，n ＝3）Tab.3 Results of content determination（mg/mL，n ＝3）

3 討論

本研究中通過篩選樣品的提取方法、展開劑種類和溶劑比例等條件，最終確定了白頭翁、兒茶、關(guān)黃柏、黃連、黃芩的TLC 定性鑒別方法。樣品的前處理分別考察不同溶劑比例、提取時間和稀釋倍數(shù)對各指標成分檢測結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)100%甲醇提取30 min，稀釋100 倍時，各指標成分分離度良好且有較好的響應值；考察了于235，250，265，275 nm 波長處的吸收峰，當吸收波長為265 nm 時，各指標成分均能出峰，且分離度較好；考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%乙酸水溶液、甲醇-0.05%乙酸水溶液等不同流動相系統(tǒng)和梯度洗脫條件，以各色譜峰峰形和分離度為指標進行比較，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相時，各色譜峰分離度和峰形均良好，且基線平穩(wěn)。最終確定了沒食子酸、葛根素、芍藥苷、黃芩苷的含量測定方法。

綜上所述，通過對醫(yī)院制劑清熱止痢合劑的TLC鑒別方法和含量測定方法的建立，并進行方法學考察，完善并提升了清熱止痢合劑的質(zhì)量標準。