植物SHMT 基因家族研究進展

倪弦之，柏浩東，韓進財，羅丁峰，李祖任，胡一鴻，金晨鐘

（1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，雜草生物學(xué)及安全防控生物學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410125）

絲 氨 酸 羥 甲 基 轉(zhuǎn) 移 酶（Serine hydroxymethyl transferase，SHMT）是高等植物的一碳化合物代謝和光呼吸過程的關(guān)鍵酶，屬于磷酸毗哆醛依賴酶。該酶可以催化甘氨酸和N5，N10-亞甲基四氫葉酸生成絲氨酸和四氫葉酸（THF），且該過程可逆[1]，反應(yīng)式如下。

SHMT 廣泛存在于原核生物和真核生物中，其在原核生物中是由單基因編碼并以二聚體形式存在；而在動物和真菌中，SHMT 則是由不同的核基因編碼的具有2 種異構(gòu)型的四聚體[2]。近年來由于SHMT 可用于體外催化生產(chǎn)絲氨酸而備受關(guān)注，同時該物質(zhì)對植物多種生理功能具有調(diào)節(jié)作用，因此關(guān)于植物SHMT的相關(guān)研究越來越多，也越來越深入。筆者主要對不同植物體內(nèi)SHMT 的多種構(gòu)型、克隆、逆境表達及其在植物保護上的應(yīng)用研究進展進行綜述，以期為植物SHMT 基因家族的功能及其相關(guān)應(yīng)用研究提供參考。

1 植物SHMT 基因家族

SHMT 基因在植物界是非常廣泛且重要的存在。植物界SHMT 基因家族同時也是一個神秘而龐大的家族。目前的研究顯示，在擬南芥中，已經(jīng)鑒定出7 個SHMT 基因[3]；在水稻中，OsSHMT 家族有5 個成員[4]；在大豆中，GmSHMT 大豆基因組包含大量的SHMT基因，約有18 個成員[5]。

植物的光合作用分為光反應(yīng)和暗反應(yīng)2 個過程。光反應(yīng)發(fā)生在葉綠體類囊體膜上，光合色素吸收光能后進行電子傳遞，形成光合作用所需的能量和還原力（ATP 和NADPH）；而暗反應(yīng)在葉綠體基質(zhì)中進行，是光合作用碳同化過程[1]。已有研究表明，植物體中存在3 種形式的SHMT，即細胞質(zhì)cSHMT、線粒體mSHMT 和葉綠體亞型SHMT[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，不同植物的基因組中都存在著可能編碼質(zhì)體SHMTs 的基因，同時在典型雙子葉植物豌豆（Pisum sativum）和典型單子葉植物大麥（Hordeum vulgare）的葉綠體中也檢測到SHMT 活性，說明cSHMT 存在于所有開花植物中[7]。當前，研究較多的是mSHMT 在植物光呼吸過程的作用機理。在植物的線粒體內(nèi)，參與光呼吸過程中的關(guān)鍵酶是SHMT。當來自于光呼吸的甘氨酸（Gly）進入線粒體中，SHMT 利用線粒體中四氫葉酸的碳將該Gly 轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸（L-Ser），同時與甘氨酸脫羧酶（GDC）配合將2 分子Gly 轉(zhuǎn)變?yōu)? 分子L-Ser、1 分子氨（NH3）和1 分子CO2。該反應(yīng)過程中GDC 和SHMT 緊密協(xié)同，促使葉酸及THF 在線粒體中合成，使整個光呼吸過程持續(xù)進行（圖1）[8-10]。

圖1 植物細胞內(nèi)光呼吸途徑示意圖

不同植物中3 種構(gòu)型的SHMT 基因表達及其含量存在差異，同一植物不同器官中亦是如此。研究發(fā)現(xiàn)，綠色豌豆葉片線粒體中純化得到的SHMT 經(jīng)過離子交換層析柱后可獲得2 個不同的峰[11]。擬南芥SHMT 基因最初是用豌豆mSHMT 基因做探針進行篩選的。擬南芥中有7 個SHMT 基因，分別為AtSHM1～AtSHM7。而擬南芥中SHMT 雖然由一個基因家族進行編碼, 但SHM1 與SHM2 蛋白產(chǎn)物可能被定位在線粒體基質(zhì)中，而其他5 個SHMT 基因編碼缺乏可識別的定位序列，只能推測可能存在于細胞質(zhì)中[12]。擬南芥線粒體中SHMl、SHM2 基因mRNA 能夠在葉片中積累并受光的強烈誘導(dǎo)，而SHM4 的mRNA 在根中積累且不受光的誘導(dǎo)，推測其在光呼吸中可能不起作用，而是參與根中C1 代謝，SHM4 基因mRNA 在幼苗根中的積累且受生物鐘調(diào)節(jié)[12]。曾廣娟等[13]用酶聯(lián)免疫法（ELISA）和免疫組織化學(xué)法（IHC） 對五年生蘋果實生樹不同節(jié)位的SHMT變化進行檢測。由此得出結(jié)論，在蘋果實生樹階段的轉(zhuǎn)變過程中SHMT 表達存在一定差異，SHMT 有且只存在于蘋果實生樹營養(yǎng)生長期的葉片中，其他生長階段和部位幾乎檢測不到其含量。

2 SHMT 基因克隆的進展

在基因功能研究中，正向遺傳學(xué)的思路通常為首先通過突變表型篩選獲得突變體，然后克隆基因，最后研究其功能。盡管目前的突變技術(shù)復(fù)雜多樣，但是常見的突變方法大致有4 種：定向誘變、移碼突變、堿基置換突變和自發(fā)突變。而目前對于SHMT 基因的研究普遍采取定向誘變，得到所需要的目的DNA 片段，再進一步完成之后的一系列基因克隆工程。基因突變技術(shù)日新月異，與之相關(guān)的基因克隆技術(shù)也呈現(xiàn)出多樣化。有的方法周期長，開展難度較大，例如mRNA 差異顯示技術(shù)、轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)、基因組減法技術(shù)、圖譜克隆技術(shù)及cDNA 文庫篩選技術(shù)等，因此在目前的試驗研究中運用較少。有的方法試驗材料廉價、操作步驟簡單、所需時間短，因此應(yīng)用較多，例如cDNA 末端快速擴增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE）。該技術(shù)是基于逆轉(zhuǎn)錄PCR 從低豐度轉(zhuǎn)錄本中快速擴增cDNA 的5'和3'末端的有效手段。該技術(shù)方法簡單，適用性廣，是目前運用較多的基因克隆技術(shù)之一。圖2 為植物界部分已知SHMT基因家族的蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進化樹。

國外開展SHMT 基因克隆研究較早，1992 年Turner 等[11]就用豌豆的SHMT 基因探針在數(shù)據(jù)庫中篩選出2 個基因（FPGHMT1，F(xiàn)PGHMT2），并用巢式PCR 法擴增其序列。Agrawal 等[14]1995 年用限制性內(nèi)切酶Nde1 和BamH1 雙酶切法從pETSH 中釋放出1 452 bp 的羊肝細胞質(zhì)基因（scSHMT），然后將該基因片段連接到另一個載體pRSET‘C’上，以檢測scSHMT 的表達。

林穎輝等[15]采用普通PCR 技術(shù)克隆得到2 條壇紫菜的SHMT 全長基因序列，分別將其命名為PhSHMT-1 和PhSHMT-2，在GenBank 中的收錄號分別為MF687405 和MF687406。通過多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析，確認這2 個基因?qū)儆赟HMT 基因家族。根據(jù)介紹，PhSHMT-1 序列全長為1 710 bp，包含了一個有1 491 對堿基的開放閱讀框，其編碼的多肽包含497 個氨基酸，等電點為4.93，分子量為121.443 kDa；PhSHMT-2 序列全長1 957 bp，其序列也包含有一個開放閱讀框，有1 395 對堿基，所編碼的多肽包含465 個氨基酸，等電點為4.95，分子量為113.969 kDa。

郭玉朋等[1]對水稻光呼吸突變體mSHMT 基因進行了克隆試驗，經(jīng)互補試驗證實水稻線粒體絲氨酸經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶基因（osmSHMT）突變，產(chǎn)生了葉綠素缺失表型。試驗采用PCR-walking 技術(shù)分離了突變體基因組T-DNA 插入位點側(cè)翼序列，比對后發(fā)現(xiàn)T-DNA 插入水稻線粒體絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶基因（osmSHMT），經(jīng)PCR 共分離驗證，確定了被標記基因與突變表型共分離，從而初步確定了突變表型可能與T-DNA 插入有關(guān)。

3 植物SHMT 家族基因在逆境下的表達研究

植物在生長發(fā)育過程中通常需要抵御各種復(fù)雜的非生物和生物脅迫，如營養(yǎng)脅迫、重金屬脅迫、溫濕度脅迫、鹽堿脅迫和蟲害、病害等。這些脅迫往往同時或接連發(fā)生，甚至存在一定的相互作用，直接影響植物的生長發(fā)育、分布狀況和基因表達等。為了抵御這些脅迫，植物在長期的進化過程中建立了復(fù)雜且精細的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。一般在遇到脅迫效應(yīng)時，植物自身的防御機制會被激活，激活的快慢與脅迫程度有較大關(guān)系，但不一定是正相關(guān)，激活后的防御機制通常伴隨著植物激素和部分重要的功能蛋白的參與，例如轉(zhuǎn)錄因子、病程相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白等。而光合作用又是植物最為重要的生理活動之一。因此，研究各種脅迫下植物捕光蛋白基因表達的變化，有重大的研究意義[16]。

圖2 部分已克隆SHMT 基因的系統(tǒng)進化樹

研究表明，中嗜熱鏈球菌中g(shù)lyA 基因表達出的SHMT 酶活性大約是大腸桿菌的2 倍，不同的外部條件下，不同生物體中SHMT 基因表達產(chǎn)生的SHMT活性存在較大差異[17]。林穎輝等[15]通過克隆壇紫菜SHMT 基因研究高溫脅迫下的SHMT 表達機理，結(jié)果顯示31℃高溫脅迫處理不同時長，PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因的表達模式幾乎一致，當31℃高溫脅迫處理12 h 時，PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因的表達水平顯著上調(diào)（P ＜0.05）；而當31℃高溫脅迫處理超過12 h 后，表達水平恢復(fù)到正常值，極有可能是PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因已經(jīng)適應(yīng)了高溫的刺激；當31℃高溫脅迫處理超過4 d 時，PhSHMT-1 和PhSHMT-2 基因的表達水平又顯著上調(diào)（P ＜0.05）。這表明高溫脅迫時間過長，藻體需要更多的谷胱甘肽以清除活性氧，因此再次激活了植物的防御調(diào)控機制。Igamberdiev 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸（L-Ser）轉(zhuǎn)化為甲酸的途徑與形成過程中的磷酸化有關(guān)，植物連續(xù)的代謝對細胞內(nèi)氧化還原和能量水平及pH 值的調(diào)節(jié)有重要影響，尤其是在應(yīng)激條件下，幾種酶的表達參與了生物化學(xué)適應(yīng)環(huán)境壓力的過程。SHMT 通過甘油酸和磷酸化絲氨酸途徑參與調(diào)節(jié)應(yīng)激植物細胞的氧化還原平衡，這些途徑是連接碳氮代謝和維持細胞氧化還原和能量水平的重要過程。Li 等[19]研究認為，在擬南芥中，GDC/SHMT 和C1-THF/SHMT 途徑通常是獨立運行的，但當植株受到逆境影響，初級GDC/SHMT 途徑受損時，替代的C1-THF/SHMT 途徑可以部分彌補絲氨酸合成的不足。Rojas 等[20]在植物與病原菌的相互作用對光呼吸和其他與植物生長所必需的初級代謝影響機理的研究中發(fā)現(xiàn)，光呼吸等初級代謝途徑參與了植物的防御反應(yīng)，并認為初級代謝在調(diào)節(jié)植物防御病原體方面具有較強的相關(guān)性。高鹽度條件下，鹽藻和集胞藻Pcc6803 細胞SHMT 活性的升高提示著SHMT 活性在耐鹽過程中發(fā)揮了重要作用，表明SHMT 的過度表達增加了藍藻的耐鹽性[21]。以上發(fā)現(xiàn)均具有相同結(jié)論，即SHMT 基因可能間接參與了植物逆境調(diào)節(jié)過程或代謝途徑彌補過程，其對于植物的逆境生理調(diào)節(jié)具有重要作用。

4 SHMT 基因家族在植物保護上的應(yīng)用

當前，人們對糧食和農(nóng)副產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量的要求日益提高，我國農(nóng)業(yè)正處于量變帶動質(zhì)變的新階段。每年因為植株自身或者外界因素而導(dǎo)致的糧食損失巨大。不管是從保護糧食解決世界人口溫飽的角度，還是從保護生態(tài)圈平衡的角度，研究并實現(xiàn)多手段的植保技術(shù)是需要長期關(guān)注的課題。以SHMT 基因為例，其作用的靶標在植物體內(nèi)是極其關(guān)鍵的。有研究指出，SHMT 嚴重減少的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯葉片中Gly 的水平比野生型高100 倍，光合作用速率降低，因此光合作用速率與Gly 水平呈負相關(guān)，與SHMT 活性呈正相關(guān)。在高光照條件下SHMT 活性降低對植物生長的負面影響十分顯著。有研究認為，當缺乏SHMT 時，植物會表現(xiàn)出生長延遲和葉片萎黃，因而SHMT 可以作為除草劑作用的新對象，通過降低SHMT 含量達到除草的目的[6]。通常認為植株加強能量是通過光呼吸促進卡爾文循環(huán)，以避免光合電子傳遞鏈被過度還原，而光呼吸功能的減弱會導(dǎo)致電子在PSI 端被氧分子融合產(chǎn)生超氧陰離子，還伴隨著過氧化氫的生成，這些活性氧如不能被及時清除，將產(chǎn)生光氧化，進而影響植株生長[22]。

SHMT 功能的變化也會通過影響光呼吸作用而影響植物生理過程。例如光呼吸能調(diào)控多種信號傳遞途徑，其中激素響應(yīng)途徑是控制植物生長發(fā)育的關(guān)鍵，而這一途徑需要依賴SHMT 的參與。除細胞氧化還原狀態(tài)會影響激素信號傳遞途徑外，在已發(fā)現(xiàn)的植物激素中，赤霉素、脫落酸等合成的部分反應(yīng)在葉綠體內(nèi)進行，而SHMT 在葉綠體中參與的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的氧氣和磷類物質(zhì)可能是影響這些植物激素合成的因素[23-24]。目前，利用植物SHMT 靶標及其生理機能進行植物保護的實際應(yīng)用研究較少。

5 結(jié)論與展望

目前，關(guān)于植物SHMT 基因家族的研究已經(jīng)有較多進展。例如SHMT 基因的命名與分類、SHMT 基因家族的主要結(jié)構(gòu)與演變和進化、SHMT 基因的主要功能。可是在植物SHMT 基因克隆及逆境表達方面的研究涉及的植物種類較少，應(yīng)用于植物栽培及抗逆、抗病蟲害等方面的研究也缺乏，但隨著植物SHMT 性質(zhì)的進一步被研究闡明，利用SHMT 的某一特殊生理功能促進植物栽培種植及保護的技術(shù)必將與高效的基因工程技術(shù)一樣廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。