延胡索提取物抗痛風作用

張旭 張權銘 董睿陶 王托

(1長春醫學高等專科學校臨床醫學部，吉林 長春 130013；2長春市十一高中；吉林大學 3生命科學學院；4藥學院)

痛風是一種關節炎癥疾病，伴隨有嚴重的關節紅腫、發熱和疼痛〔1〕。臨床上將血尿酸(UA)水平持續高于6.8 mg/dl定義為高尿酸血癥，也被認為是痛風發病的重要病理基礎〔1,2〕。基于痛風的病理特征，痛風的治療策略可分為解熱鎮痛和降低UA兩類〔3,4〕。解熱鎮痛作用藥物主要應用于痛風性關節炎急性發作期，僅能暫時緩解或抑制痛風的癥狀〔5〕。持續降低UA水平可有效防止痛風性關節炎的發作，因此有研究者認為，降低UA才是痛風治療的根本〔6〕。目前市場上的痛風藥物，如秋水仙堿、別嘌呤醇等，均伴隨有惡心、嘔吐、腹瀉等毒副作用，且作用效果單一〔4,7,8〕。臨床治療中急需一種安全性高，且既能發揮解熱鎮痛作用又能降低UA水平的痛風治療手段。延胡索是植物延胡索的塊莖，其鎮痛作用已受到廣大醫者的認同〔9〕。目前從延胡索中分離得到了多種活性生物堿成分，包括延胡索乙素、去氫紫蓳堿等20多種，展現了鎮痛、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性〔9〕。機體中黃嘌呤氧化酶(XOD)等催化嘌呤代謝產生UA的過程中，伴隨有大量活性氧(ROS)的產生。過量ROS不僅會引起組織氧化損傷，而且促進了痛風發作過程中的炎癥因子產生釋放過程〔10,11〕。目前關于延胡索在痛風疾病領域的應用研究幾乎沒有，其降低血液UA的作用仍有待確定。本研究建立高尿酸血癥小鼠模型，擬分析延胡索提取物(YHS)降UA活性及其對痛風發作過程可能的調節作用。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級雄性BALB/c小鼠，8周齡，體重18～20 g，購自遼寧長生生物制品有限公司，許可證號：SCXK(遼)2015-0001。

1.2主要試劑 延胡索塊莖(河北省安國市瑞琪中藥材有限公司)，別嘌呤醇片(世茂天街藥業有限公司)，紅細胞裂解液和細胞染色緩沖液(賽默飛世爾公司)，UA測定試劑盒和XOD測定試劑盒(Sigma-Aldrich)，ROS，丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，過氧化氫酶(CAT)，白細胞介素(IL)-1β，腫瘤壞死因子(TNF)-α，IL-8，單核細胞趨化蛋白(MCP)-1等酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(江蘇科特生物科技有限公司)。

1.3主要儀器 可調式微量移液器(10～100 μl，100～1 000 μl，Eppendorf公司)；電子天平(BP221S，德國賽多利斯)； 多功能酶標(SynergyTM4，BioTek公司)；超凈工作臺(VS-1300V，蘇州安泰空氣技術有限公司)；恒溫水浴鍋(GSY-Ⅱ，北京市醫療設備廠)；大容量冷凍離心機(5810R，Eppendorf公司)；真空冷凍凍干機(HLPHA-1-4，Christ公司)；流式細胞儀(Cytoflex，貝克曼公司)。

1.4YHS給藥溶液制備 取延胡索干燥品經初步粉碎產物100 g加入1 L去離子水混合均勻，100℃加熱2 h，6 000 r/min離心取上清，上清液經冷凍干燥后即為YHS。2 g、4 g和8 g延胡索干燥品提取獲得的等量提取物分別溶于10 ml去離子水中即得YHS低劑量(L)、中劑量(M)、高劑量(H)給藥溶液。

1.5模型建立及給藥 60只雄性健康BALB/c小鼠，經適應性喂養1 w后，隨機分為空白對照組、模型組、別嘌呤醇陽性組(AL)、YHS-L組、YHS-M組和YHS-H組各10只，AL小鼠給藥20 mg/kg別嘌呤醇，YHS-L、YHS-M和YHS-H小鼠分別給藥相應給藥溶液(等同于2 g/kg、4 g/kg和8 g/kg延胡索)。對照組和模型組小鼠灌胃等體積去離子水。給藥方式為灌胃給藥，給藥體積為10 ml/kg，連續給藥14 d。在最后3 d灌胃給藥1 h前，除去對照組小鼠，其余小鼠腹腔注射氧嗪酸鉀生理鹽水溶液(300 mg/kg)進行高尿酸血癥建模，對照組小鼠注射等體積生理鹽水。

1.6小鼠外周血免疫細胞檢測 小鼠最后一次灌胃給藥2 h后，眼底靜脈叢取血，分取100 μl血液，加入紅細胞裂解液2 ml混合均勻避光5 min后，1 200 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用200 μl細胞染色緩沖液重懸，進行流式細胞術測定。

1.7小鼠血液及組織采集 小鼠最后一次灌胃給藥2 h后，眼底靜脈叢取血，室溫放置30 min，3 000 r/min離心10 min取上清即得小鼠血清，取血后小鼠通過二氧化碳吸入法安樂死。收集小鼠腎臟和肝臟，小鼠腎臟用10%甲醛固定，肝臟和血清-80℃保存備用。

1.8小鼠腎臟病理學檢測 小鼠腎臟固定7 d后，經過50%、75%、80%、90%、100%乙醇溶液、二甲苯、二甲苯的順序進行脫水透明后，進行石蠟包埋。將小鼠腎臟石蠟塊切成5 μm的組織切片后，經過100%、90%、80%、75%、50%乙醇復水處理后，進行蘇木素-伊紅(HE)染色，封片后在顯微鏡200倍放大倍數下進行觀察。

1.9小鼠血清UA及XOD測定 使用UA檢測試劑盒和XOD檢測試劑盒測定。

1.10小鼠氧化應激相關因子及炎癥相關因子測定 使用ELISA測定小鼠血清和肝臟中ROS、MDA、SOD、GSH-Px和CAT含量，小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1含量。

1.11統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)及Dunn多重比較檢驗。

2 結 果

2.1YHS對高尿酸血癥小鼠UA及XOD含量的影響 與對照組相比，模型組血清UA水平，血液和肝臟中XOD活性顯著升高(P<0.01)，AL組顯著降低(P<0.05)。與AL組比較，YHS給藥組UA水平和XOD活性顯著升高(P<0.05)，且YHS的作用效果呈現劑量依賴性增強。見表1。

表1 YHS對高尿酸小鼠血UA及XOD 的影響

2.2YHS對高尿酸血癥小鼠氧化應激水平的影響 與對照組相比，模型組ROS水平顯著升高(P<0.01)，SOD和GSH-Px水平顯著降低 (P<0.05)。與模型組比較，YHS-H組ROS水平顯著降低，SOD、GSH-Px、CAT水平顯著升高(P<0.05,P<0.01)。AL組ROS水平顯著低于模型組(P<0.05)，見表2。

表2 YHS對高尿酸小鼠氧化應激相關因子的影響

續表2 YHS對高尿酸小鼠氧化應激相關因子的影響

2.3YHS對高尿酸血癥小鼠腎臟病理的影響 與對照組相比，模型組小鼠腎臟腎小球間隙明顯增大，腎小球出現一定程度的不規則形變。YHS-M、YHS-H組小鼠腎小球病例變化得到緩解，腎小球間隙明顯縮小。見圖1。

圖1 YHS對高尿酸小鼠腎臟病理學影響(HE，×200)

2.4YHS對高尿酸血癥小鼠炎癥相關因子的影響 與對照組相比，模型組血清中IL-1β和TNF-α水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，YHS-H組IL-1β顯著降低，AL組、YHS-L、M、H組TNF-α水平顯著降低(均P<0.01)；YHS-L組IL-8水平顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組炎癥因子比較

2.5YHS對高尿酸血癥小鼠外周血細胞的影響 與對照組相比，模型組小鼠外周血中性粒細胞比例增加了15.0%以上，YHS-M、YHS-H組比例減少了13.0%以上。YHS降低高尿酸血癥小鼠外周血中中性粒細胞的作用效果呈現劑量依賴性增強。見圖2。

圖2 YHS對高尿酸小鼠外周血中中性粒細胞的影響(P2中性粒細胞，P3單核細胞，P4淋巴細胞)

3 討 論

天然產物以其生物相容性高、活性廣泛、毒副作用小等特點，成為新藥開發的重要來源，受到越來越多研究者的關注。延胡索是傳統中醫中藥中經典的鎮痛作用藥物，現代藥學研究從延胡索中分離獲得的延胡索甲素、延胡索乙素等有效成分均顯示了很好的鎮痛作用〔9〕。高尿酸血癥作為痛風發病的基礎，其本身并不會有明顯的發病癥狀。高尿酸血癥的危害主要在于其引起的痛風、心腦血管疾病、腎臟損傷、糖尿病等并發癥，在這一過程中氧化應激損傷起到了很大作用〔12〕。在痛風發作過程中，中性粒細胞的募集及炎癥因子IL-1β等的釋放使患者患處疼痛、發熱及炎癥反應的生理生化基礎〔13,14〕，氧化應激可有效激活NL3，促進IL-1β釋放〔15〕。通過抑制中性粒細胞數量，降低氧化應激水平，抑制炎癥因子，可有效抑制痛風的發作。

本研究結果說明YHS不僅緩解了高尿酸血癥的癥狀，而且抑制了痛風發作過程中重要的生理生化變化。本文證實了延胡索具有成為痛風治療藥物的潛力，為延胡索作為抗痛風藥物的進一步開發提供科學基礎。