裸眼可視化工具盒ViMeBox助力玉米基因編輯

（2021.3.15 植物生物技術(shù)Pbj）

基因編輯技術(shù)是作物遺傳育種中一項革新性技術(shù)，應(yīng)用前景十分廣闊。基因編輯依賴遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將Cas9、sgRNA等基因編輯元件導(dǎo)入植物細(xì)胞中實現(xiàn)靶向修飾。快速剔除基因編輯元件對于基因編輯產(chǎn)品商業(yè)化研發(fā)至關(guān)重要。一方面基因編輯元件會繼續(xù)產(chǎn)生新突變，影響純合基因型的分離和表型鑒定的穩(wěn)定性和時效性;另一方面，含基因編輯元件的材料涉及外源基因插入，易引發(fā)生物安全方面的擔(dān)憂。雖然通過后代回交轉(zhuǎn)育可以去掉外源基因成分，但過程周期長、效率低、成本高，制約了技術(shù)規(guī)模化應(yīng)用。開發(fā)簡單、快速分離Cas9成分的玉米基因編輯技術(shù)有助于加速玉米育種進(jìn)程、降低監(jiān)管成本、推進(jìn)基因編輯產(chǎn)業(yè)化。模式植物中已經(jīng)開發(fā)了多色熒光，以及紫色花青素和紅色甜菜紅素的標(biāo)記系統(tǒng)，但在玉米中有效的標(biāo)記系統(tǒng)仍然較少。各色熒光蛋白需要特殊波長激發(fā)光設(shè)備等，應(yīng)用場景受限。而花青素和甜菜紅素雖然可以實現(xiàn)裸眼可視化，但由于次生代謝物合成復(fù)雜，易受環(huán)境因素影響。

為了獲得裸眼可視的篩選效果，來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院和未米生物科技（江蘇）有限公司的研究人員聯(lián)合開發(fā)了可視化基因編輯工具盒 “ViMeBox，VIsual Maize Editing toolBox”。近日，以題為“Seeing is believing： a visualization toolbox to enhance selection efficiency in maize genome editing”的研究論文在《Plant Biotechnology Journal》在線發(fā)表。

研究通過對GFP、YFP、AmCyan、DsRed2等多種熒光蛋白在玉米中開展裸眼可視效果測試，明確DsRed2表達(dá)高時肉眼可見，進(jìn)一步引入CaMV35S增強(qiáng)子提高表達(dá)量，最終實現(xiàn)了不依賴于激發(fā)光設(shè)備的裸眼可視篩選。基因編輯效率測試結(jié)果同樣表明，引入裸眼可視標(biāo)記沒有改變基因編輯效率;為進(jìn)一步擴(kuò)大裸眼可視化的應(yīng)用范圍，研究利用增強(qiáng)型的糊粉層優(yōu)選表達(dá)啟動子（CaMV35S-pHvLtp2）、胚特異性表達(dá)啟動子（eCaMV35S-pZmESP）和胚優(yōu)選表達(dá)啟動子（eCaMV35S-pZmGlb1）產(chǎn)生了多樣的裸眼可視顯色位置，為實現(xiàn)ViMeBox的多場景應(yīng)用提供了新工具。

與已報道的Cas9標(biāo)記相比，ViMeBox存在以下技術(shù)優(yōu)勢：（1）不依賴于特殊的激發(fā)光設(shè)備，在自然光下通過裸眼即可從早代玉米籽粒顏色上剔除Cas9元件;（2）不影響種子萌發(fā)和生長發(fā)育，基因編輯效率與常規(guī)方法相比無顯著差異，且不易受環(huán)境因素影響，可視效果穩(wěn)定;（3）具備多種顯色模式，可以滿足不同應(yīng)用場景。此外，ViMeBox技術(shù)與其他技術(shù)整合后，應(yīng)用前景將更為廣闊，如與新興的單倍體基因編輯技術(shù)HI-Edits或IMGE結(jié)合，在單倍體誘導(dǎo)后代材料中可以通過識別胚紅色信號快速剔除雙倍體，有效加快單倍體后代的篩選速度，有望大幅度提高HI-Edits或IMGE的工作效率。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)嚴(yán)建兵教授團(tuán)隊在職博士生、未米生物科技（江蘇）有限公司技術(shù)負(fù)責(zé)人許潔婷為論文第一作者，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉相國研究員為論文通訊作者。此外，來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的博士生簡六梅、吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的尹悅佳副研究員和陳子奇博士，以及未米生物科技有限公司的韓寶柱工程師等多名科研人員參與了本項目研究。該研究得到了國家轉(zhuǎn)基因重大專項、國家自然科學(xué)基金、吉林省農(nóng)業(yè)創(chuàng)新工程杰出青年基金項目資助。

ViMeBox研發(fā)是我國科技發(fā)展新形勢下“校-院-企”跨省跨單位跨學(xué)科聯(lián)合攻關(guān)的新型科研組織模式的成果，有效實現(xiàn)了農(nóng)業(yè)高校、地方農(nóng)科院和科技企業(yè)的技術(shù)優(yōu)勢互補(bǔ)。未米公司的前沿技術(shù)平臺、高效管理和豐富經(jīng)驗保障了載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、分子構(gòu)建和溫室種植等科研系統(tǒng)性工作的迅速開展。未來，三方將在基因編輯技術(shù)創(chuàng)新領(lǐng)域繼續(xù)合作研發(fā)，開發(fā)更多工具加入ViMeBox，使生物技術(shù)科研工作更簡易、更便捷。

特別值得注意的是，來自中國農(nóng)科院作物科學(xué)研究所謝傳曉研究組及其合作者近日也發(fā)表了利用玉米種子熒光報告系統(tǒng)輔助CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)的工作[https：//doi.org/10.1111/jipb.13086]，相信這一系列工具的推出將大大促進(jìn)我國作物基因編輯基礎(chǔ)研究及產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。