固氮芽孢桿菌N3的篩選鑒定及其對二月蘭的促生效果①

魏志敏，孫 斌，方 成，代子雯，劉滿強，焦加國，胡 鋒，李輝信，徐 莉

固氮芽孢桿菌N3的篩選鑒定及其對二月蘭的促生效果①

魏志敏，孫 斌，方 成，代子雯，劉滿強，焦加國，胡 鋒，李輝信，徐 莉*

(南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095)

從山東泰安農田土壤中篩選獲得1株固氮能力強的菌株N3，通過形態觀察、生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析，確定為巨大芽孢桿菌屬()，該菌株固氮酶活性達C2H428.33 nmol/(h·ml)。溫室條件下進行二月蘭盆栽試驗，設置不接菌對照(CK)、接種巨大芽孢桿菌N3、接種產吲哚乙酸(IAA)菌CDL29和復合接種菌株N3+CDL29四個處理，探討了接種不同植物促生菌對二月蘭的促生效果。結果表明：接種植物促生菌均促進二月蘭的生長，且單一接種固氮菌株N3的促生效果最好，其顯著提高二月蘭地上部氮、磷和地下部氮、鉀的含量，相比對照，增幅分別為33.03%、55.56% 和29.87%、51.11%，其他處理也有提高二月蘭養分含量的趨勢，但并不顯著；單一接種菌株N3，土壤有機質、全氮和速效養分含量顯著提高；接種植物促生菌均提高土壤微生物生物量碳(MBC)和氮(MBN)的含量，單一接種固氮菌株N3提升效果最佳，接種產IAA菌株CDL29和復合接種次之。此外，接種固氮菌株N3能夠顯著提升土壤固氮酶活性，接種菌株CDL29對土壤固氮酶活性沒有顯著影響。因此，單一接種固氮菌株N3在促進二月蘭生長、養分含量提高及土壤理化和生物學性質改良上都具有顯著的效果。

植物促生菌；固氮；吲哚乙酸(IAA)；二月蘭

二月蘭()是十字花科植物，具有觀賞和綠化的價值，是北方地區不可多得的早春觀花、冬季觀綠的地被植物。它還是一種實用性冬綠肥[1]，盛花期含有豐富的氮、磷、鉀等礦質元素，翻壓可以提高土壤有機碳含量，促進土壤微生物的活性，有利于保持土壤肥力[2-3]，還能提高主作物的產量和品質[4]。綠肥生物量是發揮其地面覆蓋、土壤殘留氮素截獲、土壤固碳和養分循環等農田生態服務功能的重要基礎。研究表明施用氮肥可以顯著提高二月蘭的鮮草產量、養分累積量和籽粒產量[5-6]。但現在大部分氮的施入是通過施加化肥，對土壤、作物和環境都會帶來一系列的危害[7]。有研究表明通過接種植物促生菌(PGPB)可以提高植株生物量[8-10]和養分含量[11]，并對土壤有一定的改良作用[12]。植物促生菌是在一定條件下有利于植物生長的自由生活在土壤、根際、根表、葉際的細菌[13]。它們的促生機制包括固氮、解磷、產生植物激素等[14-15]。

土壤供氮能力是綠肥作物生長的重要限制因子，特別對于非豆科綠肥作物，其生長所需氮素主要來源于土壤殘留無機氮和土壤礦化氮，因此提高土壤氮水平很重要。土壤中有一些固氮微生物可以通過生命活動，將空氣中游離態的氮素直接轉變為含氮化合物，除供自身生長發育外，部分以無機狀態或簡單的有機氮化物分泌于體外，供植物吸收利用[16]。由于植物能夠調控土壤周圍有益微生物的數量和活性[17]，植物根際土壤中微生物具有更多功能多樣性，因此，可從根際土壤中分離和選育功能各異的有益微生物[18-19]，比較不同功能微生物或者混合培養物對植物生長的促進效應。

目前植物促生菌接種綠肥作物的報道較少，不同功能微生物的復合接種更少，而且除生物量外，綠肥養分含量及對土壤性質的影響很少被關注。因此，本文嘗試從根際土壤中分離篩選高效固氮菌，結合實驗室保存的產吲哚乙酸(IAA)菌株，在溫室盆栽條件下研究單一和復合接種植物促生菌對綠肥作物——二月蘭的促生效果，以及對其養分含量和土壤性質改良方面的影響，以為綠肥作物二月蘭專用菌劑的生產和應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.2 培養基 LB培養基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，pH 7.0 ~ 7.2。Ashby無氮培養基：葡萄糖10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，pH 6.8 ~ 7.0。無機鹽培養基：(NH4)2SO42 g，NaH2PO40.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，pH 7.0 ~ 7.2。各培養基配置時均用蒸餾水定容至1 000 ml，121℃滅菌20 min，固體培養基在此配方基礎上加18 g瓊脂。

1.1.3 供試菌株 為比較篩選菌株的固氮能力和產IAA能力，選擇本實驗室已篩選獲得的成團泛菌CDL29[20]()、附著劍菌R[21]()以及購自中國農業微生物菌種保藏管理中心的固氮微生物圓褐固氮菌YH[22](，菌株編號為ACCC10006)、巴西固氮螺菌B[23](，菌株編號為ACCC10104)進行對比。

1.2 固氮菌的篩選及功能測定

稱取10 g土樣，將其置于裝有適量玻璃珠和90 ml無菌水的250 ml三角瓶中，30℃、180 r/min振蕩20 min，靜置10 min，得到土壤懸浮液。采用梯度稀釋法稀釋至10–6后，吸取0.1 ml涂布在Ashby固體培養基上，平板置于30℃恒溫箱中倒置培養24 h后，將不同類型典型單個菌落挑出，經平板多次純化后，4℃保存在Ashby固體培養基斜面待用。

固氮酶活性的測定：采用乙炔還原法[24]。將篩選的固氮菌及對比菌株分別接入LB液體培養基中，培養24 h后用離心法收集菌細胞；再用無氮液體培養基重懸菌體，制成108CFU/ml的固氮菌懸液，作為待接種菌液；接種制好的固氮菌懸液于裝有2 ml無氮液體培養基的青霉素小瓶中，30℃培養24 h；用密封性好的注射器先從培養有菌的青霉素小瓶抽取1 ml空氣，再注入1 ml乙炔，用膠布密封針眼；繼續培養24 h，取100 μl氣樣在氣相色譜儀上測定乙烯峰值。

采用Agilent 7890A氣相色譜儀進行測定，其工作條件設置為：前進樣口溫度200℃，前檢測器(FID)溫度250℃，分離比5∶1，載體流速1 ml/min，氫氣流速30 ml/min，空氣流速300 ml/min，尾吹氣(氮氣)流速26 ml/min；柱溫為梯度升溫：32 ℃保持1 min，32 ~ 70℃升溫速度為30 ℃/min，70℃保持5 min，70 ~ 160 ℃升溫速度為10 ℃/min，160 ℃保持15 min。乙炔還原活性計算公式為：乙炔還原活性ARA(C2H4，nmol/(h·ml))=(實際C2H4× 峰面積標注氣含量× 青霉素瓶容積)/(標準氣峰面積× 進樣量× 培養時間× 樣品量)。

產IAA功能測定：將分離純化后的細菌及對比菌株，接種于含有L-色氨酸(100 mg/L)的LB液體培養基中，180 r/min、30℃條件下搖床培養1 d。吸取2 ml菌液于離心管，10 000 r/min離心10 min，取1.5 ml上清液并加入等體積Salkowski比色液(50 ml 35% HClO4+ 1 ml 0.5 mol/L FeCl3)于5 ml離心管中，避光靜置30 min，測定其OD530值。對照標準曲線計算單位體積發酵液中IAA的含量。標準曲線的繪制采用分析純的IAA梯度稀釋制備。

1.3 N3菌株的生理生化及16S rDNA序列分析

1.3.1 形態及生理生化特征測定 接種固氮菌N3于Ashby固體培養基平板上，觀察菌落、菌體形態[25]。參考《常見細菌系統鑒定手冊》和《微生物學實驗》測定相關生理生化特征[26]。

由受力分析可知，只要有傾角產生，便會有水平方向的水平分力，也會由此產生一個加速度，也就是說無人機俯仰的速度會越來越大，如果向下速度過大會導致無人機無法及時拉升從而墜落損壞，因此俯仰運動一般不能產生較大傾角[19]。

1.3.2 16S rDNA 測序與系統學分析 常規方法培養菌株，SDS-CTAB法提取細菌基因組總DNA，作為擴增模板，采用16S rDNA通用引物27f(5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(5'-TAC-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進行16S rDNA的PCR擴增，擴增片段長度為1.5 kb。PCR反應條件：94℃預變性5 min，進入熱循環，94 ℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸10 min，共30個循環。DNA測序由南京思普金生物科技有限公司完成，再將所得序列在NCBI進行比對，使用MEGA 5.1軟件以NJ法建立系統發育樹。

1.4 二月蘭溫室促生試驗

1.4.1 試驗設計 將篩選出的固氮能力強的菌株N3和產IAA能力強的菌株CDL29分別接種于LB液體培養基，30℃、180 r/min搖床培養24 h后，在無菌條件下將菌液倒入已滅菌的離心管中，8 000 r/min離心5 min，去掉上清液，再用無菌水重懸菌體，制成菌懸液。

取山東泰安種植花生的土壤3 kg裝盆，每盆種植15顆二月蘭，二月蘭種子首先用3% 雙氧水進行表面消毒20 min，再用無菌水沖洗。菌液接種量按108CFU/g土接入，復合處理中兩株菌比例為1∶1，對照為接種等量無菌水，每個處理設4個重復，控制含水量至田間最大持水量的80%。種植4個月后，每盆采集長勢一致的二月蘭3株測定生物量、養分含量和根系形態及活力指標，同時采集土壤樣品，測定土壤養分含量、微生物生物量碳和氮(MBC、MBN)含量及固氮酶活性。

1.4.2 指標測定 植株根系指標測定：根系掃描儀(LA1600+scanner，Canada)掃描二月蘭根系形態，獲取根系圖像(Winrhizo2003b，Canada)進行相關根系指標分析。二月蘭根系活力測定采用TTC法。

植株養分含量測定：H2SO4-H2O2消煮法，植株氮含量采用凱氏定氮法，磷含量采用鉬藍比色法，鉀含量采用火焰光度計法。

土壤理化和生物學性質測定：pH采用無CO2水浸提pH計法(土水質量比1∶2.5)測定；有機質含量采用重鉻酸鉀容量法測定；全氮含量采用半微量開氏法測定；全磷含量采用HClO4-H2SO4法測定；有效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO3法測定；速效鉀含量采用NH4OAc浸提，火焰光度計法測定；土壤NH4+-N、NO– 3-N采用2 mol/L KCl溶液浸提，流動分析儀( SEAL Auto Analyzer3，德國) 測定；土壤MBC、MBN采用氯仿熏蒸-硫酸鉀浸提法，K2CrO7外加熱法測定MBC含量，半微量凱氏定氮法測定MBN含量。

土壤固氮酶活性測定；采用乙炔還原法，取盆栽土樣15 g于100 ml血清瓶中，加入0.1 mol/L葡萄糖液2 ml，搖勻，塞上異丁基膠塞，加鋁蓋密封。用注射器從瓶中抽出5 ml空氣再注入等體積乙炔氣體，密封針眼，28℃培養2 d。培養結束后，取500 μl氣樣在氣相色譜儀上測定乙烯峰值(測定儀器和參數設置與菌株固氮酶活性測定一致)。乙炔還原活性計算公式為：

乙炔還原活性ARA(C2H4，μmol/(h·g))=

式中：為乙烯峰高/乙炔峰高；為絕對溫度；為測定時的氣溫；為測定時的大氣壓；760為標準大氣壓(汞柱)；為注入乙炔的量(ml)；22.4為1 g分子氣體在絕對溫度和標準大氣壓下的體積；為測定樣品的干重(g)，為注入乙炔后的反應時間(h)。

1.5 數據處理

利用Microsoft Excel 2007軟件處理數據，并運用SPSS 20.0對數據進行單因素方差分析，對其顯著性差異(<0.05)用LSD和Duncan’s 檢驗法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 固氮菌的篩選及功能測定

本研究從供試土壤中分離得到3株具有固氮能力的菌株，分別命名為N1、N2、N3。對菌株固氮酶活性和產IAA能力進行測定，結果如圖1所示，菌株N3固氮能力最強，固氮酶活性達C2H428.33 nmol/(h·ml)，與其他菌株間差異達到顯著水平。菌株成團泛菌(CDL29)產IAA能力最強，培養24 h時IAA產生量達15.76 mg/L。

2.2 固氮菌N3的鑒定

2.2.1 形態及生理生化特征測定 篩選出的固氮菌株N3，如圖2所示，在無氮培養基上形成的菌落較小，為白色隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，不透明，不規則桿狀排列。該菌生理生化特性是：革蘭氏陽性，兼性好氧，化能異氧，接觸酶陽性，VP試驗陰性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性，硝酸鹽還原陰性。

2.2.2 16S rDNA序列分析及菌種初步鑒定 經16S r DNA序列分析和NCBI數據庫在線比對，結果顯示，N3與的同源性達100%，序列登入號為MK391574。用MEGA 5.1軟件以NJ法建立系統發育樹(圖3)，N3與(MF187637.1)同源性最高，結合形態以及生理生化特征鑒定菌株N3為巨大芽孢桿菌屬()。

2.3 植物促生菌接種二月蘭溫室促生試驗

2.3.1 接種植物促生菌對二月蘭生長的影響 由表1可知，與CK相比，各接種植物促生菌處理二月蘭地上部和地下部鮮重、株高和莖粗都增加，表明接種植物促生菌能促進二月蘭的生長。接種菌株N3處理二月蘭地上部和地下部鮮重、株高和莖粗顯著增加且數值最大，說明接種固氮菌株N3處理對二月蘭的促生效果好于接種產IAA菌株CDL29處理和復合菌株接種處理。

二月蘭接種植物促生菌后，根系生長發育指標：根系總長、表面積、體積以及根尖數都有顯著性提高，特別是N3處理，接種固氮菌株N3后二月蘭根系總長、表面積、體積、根尖數較CK分別提高1.27倍、1.28倍、1.48倍、1.11倍(表1)。

此外，接種植物促生菌能顯著提高二月蘭根系活力，其中以接種固氮菌株N3處理最高，達0.16 mg/(g·h)，但接種菌株CDL29處理和復合接種N3+CDL29處理間沒有顯著差異(圖4)。

由表2可知，與CK相比，各接種植物促生菌處理二月蘭植株地上和地下部氮、磷、鉀養分含量有所增加，表明接種植物促生菌對二月蘭植株的養分含量有一定的積累作用。單一接種固氮菌株N3處理能顯著提高二月蘭地上部氮、磷和地下部氮、鉀的含量，相比CK，增幅分別為33.03%、55.56% 和29.87%、51.11%。單一接種產IAA菌株CDL29處理以及復合接種處理也有促進二月蘭養分含量的趨勢，但并不顯著。

表1 不同處理對二月蘭生長發育的影響

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(<0.05)，下同。

2.3.2 接種植物促生菌對二月蘭盆栽土性質的影響 由表3可知，接種植物促生菌對土壤pH影響不大，但能夠提高土壤有機質、全氮、全磷和速效養分含量。單一接種固氮菌株N3處理能顯著提高土壤全氮、NH+ 4-N和NO– 3-N含量，較CK分別提高了0.21倍、1.21倍和1.01倍。

接種植物促生菌均有效提高土壤MBC和MBN含量，單一接種固氮菌株N3處理提升效果最佳，土壤MBC和MBN含量達272.93 μg/g和91.55 μg/g(圖5)，復合菌株接種處理土壤MBC和MBN提升效果不如單一接種處理。

表2 不同處理對二月蘭植株養分含量的影響(g/kg)

表3 接種植物促生菌對土壤理化性質的影響

由圖6可知，與CK相比，單一接種產IAA菌株CDL29處理并不影響土壤固氮酶活性，而單一接種固氮菌株N3處理能夠顯著提高土壤固氮酶活性，達C2H444.97 nmol/(g·h)，與CK相比提升了1.35倍。

3 討論

接種植物促生菌對二月蘭有一定的促生作用，且不同植物促生菌對二月蘭的促生效果不同，接種固氮菌株N3對二月蘭的促生效果好于產IAA菌株CDL29和復合菌株接種處理，較不接菌處理二月蘭地上部鮮重、株高和植株地上部氮、磷、鉀養分含量分別顯著提高了227.66%、56.12%、33.03%、55.56% 和31.94%。這與本實驗室徐文思等[27]篩選獲得的產IAA菌株JX15和姜瑛等[28]篩選的固氮解磷菌株JX14接種花生盆栽試驗結果“產IAA菌和固氮菌對花生具有很好的促生作用，能夠顯著促進花生生物量和株高的增加，且兩者對花生的促生效果不同”一致。由于土壤供氮是綠肥作物生長的重要限制因子，特別對于非豆科植物二月蘭，接種固氮菌株對土壤固氮微生物發揮重要的作用[29]。

接種植物促生菌對二月蘭根系生長發育有較好的促生作用，根系總長、表面積、體積以及根尖數和根系活力都顯著增加，且二月蘭植株地上和地下部氮、磷、鉀含量都有增加的趨勢。李冰等[30]研究表明，小麥幼苗接種植物根際促生菌后，對小麥根的總長度、總表面積、根尖數有明顯促生作用，且這些指標與小麥根干重、株高和莖干重顯著相關。鄭文波等[31]研究表明，接種產IAA、解磷菌株ZH5能提高花生根系的根長、根表面積、根體積和根尖數，說明菌株ZH5對花生根系生長發育有較好的促進作用，進而提高花生植株全磷養分含量。根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養狀況及產量水平。接種植物促生菌處理二月蘭根系具有更多的分支并且更長更粗，增加了對養分的接觸面。此外，根系活力的增加促進了二月蘭對土壤中營養元素的吸收，進而提高了其地上部鮮重、株高以及氮、磷、鉀養分含量。

土壤微生物作為土壤生態系統的重要組成部分，其量的變化是評價土壤肥力高低的重要依據[32]。土壤固氮酶活性在一定程度上能夠反映土壤固氮微生物固氮酶作用能力及強弱。接種固氮菌株N3，能提高土壤脲酶活性，并且可以提高細菌總代謝活性[33]，通過固氮作用，將空氣中游離態的氮素直接轉變為含氮化合物[34]，能顯著提高土壤全氮、NH+ 4-N和NO– 3-N含量。王慧橋等[35]研究表明，不同自生固氮菌均能提高玉米土壤有效氮含量，活化的養分更有利于二月蘭的生長和吸收利用。本試驗表明，接種植物促生菌對土壤pH影響不大，但能夠提高土壤有機質、全磷、有效磷和速效鉀含量。接種植物促生菌均有效提高土壤MBC和MBN的含量，接種固氮菌株N3處理提升效果最佳，這與固氮菌株N3分離篩選于本試驗所用土壤，屬于土著微生物，相比產IAA菌株CDL29具有更好的適應性，更有利于功能的發揮有關。復合接種相比單一接種可能存在資源的競爭，從而提升效果不如單一接種處理。接種固氮菌株N3后，土壤固氮酶活性最高，這與固氮菌株N3有較強的固氮酶活性直接相關，同時土著固氮菌株N3的強適應能力及定殖能力也是原因之一。

4 結論

本試驗篩選出了1株固氮能力較強的菌株N3，固氮酶活性達C2H428.33 nmol/(h·ml)，通過細菌形態和生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析，鑒定為巨大芽孢桿菌屬()。將該菌接種于二月蘭能有效促進其生物量的增加、根系發育，提高二月蘭氮、磷、鉀養分的積累，同時有效提高土壤速效養分、有機質、MBC和MBN含量及固氮酶活性。接種產IAA菌CDL29同樣能夠促進二月蘭生長，但在二月蘭養分積累和土壤性質改良效果上不如接種固氮菌N3。復合接種兩株菌效果低于單一菌株處理，可見菌株之間的競爭可能會影響效果的發揮。

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Isolation and Characterization of Bacillus Nitrogen-Fixing Bacteria and Its Growth- Promotion on

WEI Zhimin, SUN Bin, FANG Cheng, DAI Ziwen, LIU Manqiang, JIAO Jiaguo, HU Feng, LI Huixin, XU Li*

(College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

A strain N3 with strong nitrogen fixation ability was selected from the farmland soil in Taian, Shandong Province and was identified asbased on the morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequences analysis. Its nitrogenase activity was up to C2H428.33 nmol/(h·ml). Four treatments were set to explore the inoculation effect of different plant growth-promoting bacterium on the growth of, including single or double inoculation of strain N3 or IAA (indole-3-acetic acid)-producing stainCDL29, plant without any inoculation set as the control treatment (CK). The pot experiment ofwas conducted under greenhouse conditions. The results showed that all plant growth-promoting bacteria promoted the growth of, and the treatment with single inoculation of nitrogen-fixing strain N3 was the best. At the same time, nitrogen and phosphorus contents in the shoots ofnitrogen and potassium contents in the roots ofwere significantly increased by the single inoculation of nitrogen-fixing strain N3, which were increased by 33.03%, 55.56% and 29.87%, 51.11% respectively compared with CK. Other treatments also promoted nutrient contents in, but the trends were not statistic significant. The contents of soil organic matter, total nitrogen and available nutrients were significantly increased by single inoculation of nitrogen-fixing strain N3. The contents of soil microbial carbon(MBC) and microbial nitrogen(MBN) were increased by the inoculation of different plant probiotics, single inoculation of nitrogen-fixing strain N3 had the best effect, followed by the single inoculation of IAA-producing stain CDL29 and compound inoculation. In addition, inoculation of nitrogen-fixing strain N3 significantly increased soil nitrogenase activity, while inoculation of CDL29 had no significant effect on soil nitrogenase activity. As a conclusion, the single inoculation of nitrogen-fixing strain N3 could significantly promote the growth, nutrient contents inand also improve the physicochemical and biological properties of the soil.

Plant growth-promoting bacterium; Nitrogen fixation; IAA;

S154.1

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.01.009

魏志敏, 孫斌, 方成, 等. 固氮芽孢桿菌N3的篩選鑒定及其對二月蘭的促生效果. 土壤, 2021, 53(1): 64–71.

國家綠肥產業技術體系項目(CARS-22-G-10)、公益性行業(農業)科研專項經費(201503121)和江蘇省優勢學科項目資助。

(xuli602@njau.edu.cn)

魏志敏(1994—)，男，江西南昌人，碩士研究生，主要從事植物促生菌的篩選及其對綠肥的促生研究。E-mail：2017103026@njau.edu.cn