雙委夜蛾感覺神經元膜蛋白編碼基因鑒定及組織表達譜分析

宋智煜，陳雙臣，白小軍，董鈞鋒，宋月芹*

(1.河南科技大學林學院，河南洛陽471000；2.宜陽縣林業技術指導站，河南洛陽471600)

昆蟲的化學感受系統在其生存和繁殖過程中起著極其重要的作用(Kaupp，2010；Sunetal.，2014；Zhangetal.，2015)。研究者對昆蟲觸角嗅覺信號傳導的分子機制研究有了突出的進步：在昆蟲嗅覺識別時，氣味分子從觸角感器孔滲入，然后被氣味結合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)或化學感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)識別和轉移，最后激活位于嗅覺感覺神經元(olfactory sensory neurons，OSNs)樹突膜上的嗅覺受體(odorant receptors，ORs)或離子型受體(ionotropic receptors，IRs)，產生電位，指導昆蟲做出相應的行為反應(Bentonetal.，2009；Leal，2013；Britoetal.，2016；de Fouchieretal.，2017；Yangetal.，2017)。此外，還有一些蛋白如感覺神經元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins，SNMPs)在昆蟲氣味識別過程中也扮演著至關重要的角色(Leal，2013)。

昆蟲SNMPs是一種膜蛋白，與脊椎動物CD36家族為同源基因，具有2個跨膜區域，其功能主要是識別和轉運親脂性氣味分子如脂肪酸和脂類化合物等(Rogersetal.，1997，2001a；Febbraio & Silverstein，2007；Levyetal.，2007；Vogtetal.，2009；Martinetal.，2011)。昆蟲第一個SNMP基因被鑒定在多音蠶蛾Antheraeapolyphemus中，命名為ApolSNMP1。隨后SNMP的第二個亞類型在煙草天蛾Mauducasexta中被發現，命名為MsexSNMP2(Rogersetal.，1997，2001a，2001b)。緊接著SNMP的同源基因在鱗翅目Lepidoptera(Rogersetal.，2001a，2001b；Forstneretal.，2008)、雙翅目Diptera(Jinetal.，2008)、鞘翅目Coleoptera(Nichols & Vogt，2008)、直翅目Orthoptera(Vogtetal.，2009)和膜翅目Hymenoptera(Huetal.，2013)等昆蟲中都有發現。SNMP基因家族一直以來被認為只有2個成員，即SNMP1和SNMP2。而昆蟲SNMP家族的第三個成員SNMP3在鱗翅目中被鑒定(Zhangetal.，2018)，被認為主要與昆蟲的免疫反應有關，這還需要進一步證明。

雙委夜蛾Athetisdissimilis屬鱗翅目夜蛾科Noctuidae委夜蛾屬Athetis，近年逐漸成為小麥Triticumaestivum和玉米Zeamays地的主要害蟲。外形類似于二點委夜蛾A.lepigone，食量極大，對小麥和玉米產量造成極大的威脅(王振營等，2012；郭婷婷等，2016a,2016b)，發展新型友好的殺蟲劑迫在眉睫。本研究鑒定了雙委夜蛾的2個SNMP基因，即AdisSNMP1和AdisSNMP2，并通過熒光定量PCR技術對雙委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2在不同組織中的表達情況進行分析。以期為進一步探索雙委夜蛾SNMPs的化學通訊功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試蟲的準備

雙委夜蛾來自河南科技大學林學院昆蟲實驗室，該群體為自2012年7月在河南省洛陽市周邊玉米田誘集的成蟲，在室內繼代飼養至今(宋月芹等，2015)。室內飼養條件為：溫度27 ℃±1 ℃，相對濕度80%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 總RNA的提取與第一鏈cDNA的合成

選取雙委夜蛾羽化后第3天的雌雄成蟲，收集觸角各50頭、頭部各30頭、胸部各20頭、腹部各3頭、足各30頭、翅各50頭，每個樣品收集重復 3次。將雙委夜蛾各部分組織解剖后立即放入浸在液氮中的1.5 mL離心管內，-80 ℃保存。

總RNA的提取采用RNAiso Plus Kit(TaKaRa，北京)試劑盒進行，并使用RNase-free DNase I(TaKaRa，北京)對提取的RNA進行除DNA處理。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000c分光光度計(Thermo Scientific)進行質量檢測。采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，北京)試劑盒對RNA進行反轉錄。

1.3 雙委夜蛾SNMPs基因的克隆

從本實驗室前期對雙委夜蛾觸角轉錄組測序注釋結果中(Dongetal.，2016)搜索到2個SNMP基因。根據該序列設計特異性引物，AdisSNMP1-F：5’-ATGGCGCTTCCTAAGGAGATA-3’，AdisSNMP1-R：5’-AATGTACAACTAGAACCGACC-3’；AdisSNMP2-F：5’-ATGTTGGGAAAACATTCGAAAATG-3’，AdisSNMP2-R：5’-AGTTAAGGGAAATAATTGCACTC-3’。PCR反應體系為20 μL：雌蛾觸角cDNA模板1 μL，上、下游引物各1.5 μL(10 μmol·L-1)，dNTPs混合液 1.6 μL(2.5 μmol·L-1)，Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL(TaKaRa，大連)，10×Ex Taq buffer 2 μL，ddH2O 12.2 μL。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；最后72 ℃ 10 min。膠回收目的片段，將目的片段克隆到pMDTM19-T載體上，轉化DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆培養過夜，送去測序。

1.4 雙委夜蛾SNMPs基因的序列分析

核酸序列采用在線工具(http://www.bio-soft.net/sms/)翻譯；采用在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進行跨膜區域預測；利用在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)對蛋白序列特性進行分析；采用在線工具(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白親疏水性；采用線下DNAMAN進行多重序列比對；采用線下MEGA 6.0構建進化樹。

1.5 熒光定量PCR

通過熒光定量PCR檢測雙委夜蛾SNMPs基因在不同組織中的表達情況。根據雙委夜蛾SNMPs基因的開放閱讀框和熒光定量引物設計原則設計特異性引物(5’-3’)，AdisSNMP1-F：TCCTGTTCCCTGTCATACTCAA，AdisSNMP1-R：GTGCCCTCTCCTTTAGTAACAG，AdisSNMP2-F：CTGCTCTACTAACGGTCCACGA，AdisSNMP2-R：ACGAAACCCTGACCACACGCCT。內參基因為雙委夜蛾GADPH基因，引物為：AdisGADPH-F：CTGCTCATTTAGAGGGTGGTGC；AdisGADPH-R：TCTTCTGGGTAGCGGTGGTAG。

熒光定量PCR在ABI 7500 PCR儀(ABI，Carlsbad，CA，USA)上進行，每個反應體系20 μL，包括10 μL的2×SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa，大連)、0.8 μL的正反向引物(10 μmol·L-1)、2 μL的cDNA模板(200 ng)和6.4 μL的DEPC水。PCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個循環。試驗重復3次。

1.6 數據分析

所有SNMPs基因在雙委夜蛾不同組織中的相對表達量為ΔCt=Ct目標基因-Ct內參基因。利用SPSS 17.0中的ANOVA方法對AdisSNMPs基因在雙委夜蛾不同組織中的表達量進行差異比較(新復極差法檢驗，P≤0.05)。

2 結果與分析

2.1 雙委夜蛾SNMPs基因克隆及序列特征

反轉錄及PCR結果(圖1)顯示，在1 000～2 000 bp之間有1條明顯的單一條帶，結果與預期大小相符。測序結果在NCBI上的同源性搜索結果表明，所測序列與多種昆蟲的SNMP基因序列高度同源，證明這2個基因就是雙委夜蛾的SNMP基因，分別命名為AdisSNMP1和AdisSNMP2，GenBank登錄號分別為MT954936和MT954937。

M. DNA Marker DL2000, 1.AdisSNMP1, 2.AdisSNMP2

這2個SNMPs基因都具有全長的開放閱讀框，AdisSNMP1長度為1 572 bp，編碼523個氨基酸(圖2)；而AdisSNMP2長度為1 563 bp，編碼520個氨基酸(圖3)。這2個基因編碼蛋白質都是酸性，AdisSNMP1的等電點是5.96，蛋白分子量是59.09 kD；AdisSNMP2的等電點是5.69，蛋白分子量是58.72 kD。

雙委夜蛾2個SNMPs基因的親水性和疏水性預測發現，AdisSNMP1和AdisSNMP2在氨基酸序列的C-端和N-端跨膜區域有2個明顯的疏水位點(圖5)。

2.2 雙委夜蛾SNMPs與其他昆蟲SNMP基因的同源性及進化樹分析

將雙委夜蛾AdisSNMP基因與已報道的其他昆蟲SNMP基因的氨基酸序列在NCBI中的Blastp在線搜索工具進行同源性分析，發現AdisSNMP基因與不同種類昆蟲SNMP基因差別較大。與同目昆蟲SNMP基因一致性較高，如AdisSNMP1與小地老虎AgrotisipsilonAipsSNMP1序列一致性為85.69%；與斜紋夜蛾SpodopteralituraSlitSNMP1序列一致性為86.64%。AdisSNMP2與小地老虎AipsSNMP2序列一致性為86.54%；與斜紋夜蛾SlitSNMP2序列一致性為85.38%。與不同目昆蟲SNMP基因一致性較低，如AdisSNMP1與煙飛虱BemisiatabaciBtabSNMP1序列一致性為33.84%；與茶翅蝽HalyomorphahalysHhalSNMP1序列一致性為37.45%。AdisSNMP2與煙飛虱BtabSNMP2序列一致性為27.27%；與茶翅蝽HhalSNMP2序列一致性為25.52%。雙委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2序列一致性為27.05%。

使用MEGA 6.0對11種昆蟲的SNMP同源基因進行進化樹比較。SNMPs基因被分成2個亞組，即SNMP1和SNMP2(圖6)。雙委夜蛾的AdisSNMP1和AdisSNMP2基因分別被聚集到這2個亞組，并且與同為鱗翅目昆蟲的小地老虎和斜紋夜蛾SNMP基因進化關系最近，與其他目昆蟲SNMP關系較遠。

2.3 雙委夜蛾SNMPs基因表達譜分析

使用熒光定量PCR對雙委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2在不同組織中的表達情況進行分析，結果發現：AdisSNMP1和AdisSNMP2在雌雄蛾觸角中高度表達，雄蛾的表達量普遍比雌蛾高。除觸角外，AdisSNMP1幾乎不在其他組織中表達或表達量甚微。AdisSNMP2除在觸角中表達量豐富外，在足中也有少量表達(圖7)。

3 討論

本研究根據前期雙委夜蛾觸角轉錄組的數據，通過BLASTX在線搜索和同源性比較鑒定出2個SNMPs基因，即AdisSNMP1和AdisSNMP2。這2個基因與其他昆蟲SNMPs具有類似的特征，如在氨基酸序列N端和C端附近有2個保守的跨膜區域，并且由6個保守的半胱氨酸殘基形成二硫鍵組成一個大的胞外環，此結構也與CD36基因家族極其相似(Huangetal.，2016；Sunetal.，2019；Yangetal.，2020)。根據對這2個跨膜蛋白結構投影預測，這部分的功能是轉運和結合脂類分子(Herbosoetal.，2011；Pregitzeretal.，2014)，推測雙委夜蛾SNMPs的2個跨膜區具有同樣的功能。

雙委夜蛾AdisSNMP基因同源性搜索發現AdisSNMP基因與不同種類昆蟲SNMP基因差別較大。與同目昆蟲SNMP基因一致性較高，與不同目昆蟲SNMP基因一致性較低。雙委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2之間序列一致性也比較低。進化樹結果也顯示，雙委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2分別被聚集到SNMP1和SNMP2，在同一組內，同為鱗翅目昆蟲的SNMP基因進化關系最近，與其他目昆蟲SNMP關系較遠。此結果與大多數昆蟲SNMP基因特性相同(Guetal.，2013；胡穎穎等，2013；Yangetal.，2020)。在鱗翅目中曾經鑒定出SNMP3亞家族基因(Zhangetal.，2018)，而在雙委夜蛾觸角轉錄組數據中沒有發現該基因，可能是這個基因在幼蟲腸中高度表達的原因。

組織特異性表達可以為功能預測提供可靠性的參考。本研究發現雙委夜蛾SNMP1主要表達在雌雄蛾的觸角中，此結果與多音蠶蛾(Rogersetal.，1997)、臍橙螟Amyeloistransitella(Lealetal.，2009)和甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Liuetal.，2014)等多種昆蟲SNMP1的表達模式相同。Benton等(2007)在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中發現，DmelSNMP1能夠識別集合信息素cVA，激活受體HR13。Pregitzer等(2014)在煙芽夜蛾Heliothisvirescens中也發現，HvirSNMP1能明顯增強HR13對信息素Z11-16:Ald的結合力。以上研究都暗示昆蟲SNMP1的功能是調節信息素的識別和通過SNMP-OR互作轉運信息素。相對于AdisSNMP1，AdisSNMP2的表達相對廣泛，除嗅覺感器觸角外，在非嗅覺感器足中也有少量表達，此結果與小菜蛾Plutellaxylostella(Li & Qin，2011)、二化螟Chilosuppressalis(Liuetal.，2013a)、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis(Liuetal.，2013b)和甜菜夜蛾(Liuetal.，2014)一致。昆蟲身體上分布有大量的味覺感器(Montell，2009)，而CD36蛋白的主要功能是轉運脂類化合物，因此可推測AdisSNMP2和GRs在這些組織中共同表達，識別脂類分子完成味覺過程。

本研究通過前期雙委夜蛾觸角轉錄組數據鑒定出 2個SNMPs基因，并且研究了這些基因在雙委夜蛾不同組織中的表達情況，不僅豐富了昆蟲SNMPs基因的數量，也為今后對雙委夜蛾SNMPs基因功能的研究提供參考。