刀鱭MSTN基因遺傳多態性與生長性狀的關聯分析

于愛清 施永海 徐嘉波

(上海市水產研究所，上海市水產技術推廣站，上海 200433)

刀鱭(Coiliaectenes)又名長頜鱭，俗稱刀魚、毛刀魚，隸屬于鯡形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulidae)、鱭屬(Coilia)，富含以γ-氨基酸為代表的活性氨基酸和不飽和脂肪酸，具有較高的經濟、營養和養殖價值。歷史上我國長江刀鱭的自然種質資源極為豐富，加上其漁汛相對穩定，因而成為長江流域中下游的重要捕撈對象。近年來，由于酷漁濫捕、水域環境污染、水文條件改變、生態環境惡化和海岸工程建設等因素，長江刀鱭的自然種質資源急劇衰退，年捕獲量波動很大，呈現出年獲量逐年降低且個體小型化的趨勢，甚至無法形成優勢種群，對刀鱭種質資源進行保護和恢復已迫在眉睫[1-2]。隨著我國刀鱭規模化人工繁養技術的突破，其養殖產業的規模日趨擴大，但是在養殖生產過程中，仍然存在生長速度減慢、應激性能差異大、大小規格分化嚴重和良種匱乏等問題，嚴重制約了長江刀鱭產業化的進程。因此，亟需培育生長快、抗逆性強的新品系以促進刀鱭養殖產業的可持續發展。

肌肉生長抑制素(myostatin，MSTN)又稱為生長分化因子-8(growth and differentiation factor 8，GDF-8)，是轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族的重要成員，能夠通過抑制生肌決定因子家族成員的轉錄活性來調控肌肉細胞的生長發育[3-4]。MSTN基因最初由McPherron等[5]從小鼠的骨骼肌細胞中分離獲得，并被鑒定為肌肉生長發育的負調控因子。后續的研究證實，敲除MSTN基因的小鼠肌肉質量是正常野生型小鼠的2～3倍[6]，且缺失突變純合體的小鼠產生了類似于比利時藍牛(Belgian Blue)、皮埃蒙特牛(Piedmontese)等家畜品種的雙肌表型[3-4]。在水產動物研究領域，基于基因編輯技術或RNAi技術抑制水產動物MSTN基因的功能，亦能夠導致青鳉(Oryziaslatipes)[7]、斑馬魚(Daniorerio)[8]和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[9]等試驗魚類的肌肉明顯發達于正常魚，證實了MSTN基因能夠負調控魚類肌肉的生長和發育，在魚類良種選育方面具有重要研究價值。

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指在基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A、T、C或G)的突變而引起的多態性，具有數量多、分布廣、遺傳穩定性強、二等位性及易于自動化檢測等優點，被廣泛應用于水產動物標記輔助選擇、QTL定位和動植物遺傳圖譜構建等方面的研究中[10-11]，具有巨大的潛力和應用前景。在水產動物育種過程中，基于生長相關候選基因的多態性與生長性狀的關聯分析結果，篩選出與生長性狀顯著相關的位點，有助于在繁育親本的早期培育過程中進行有效地篩選，從而提高選育效率，縮短良種培育進程。目前，SNP分型的方法主要有直接測序法、TaqMan探針法、PCR-LDR分型技術、PCR-RFLP法、飛行質譜檢測法和SNaPshot分型技術等。其中，SNaPshot基因分型方法，又被稱為小測序，主要是基于熒光標記單堿基延伸原理而獲得樣本精準基因型的中通量SNP分型技術，被廣泛應用于大口黑鱸(Micropterussalmoides)[12]、草魚(Ctenopharyngodonidella)[13]及尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[14]等水產動物SNP位點的檢測和分型研究。基于MSTN基因在遺傳育種上的潛在應用價值，從無脊椎動物到脊椎動物研究領域的相關報道，以及其被作為重要經濟物種遺傳改良重要候選基因[3]的研究背景，本研究將MSTN基因作為刀鱭生長性狀遺傳改良的重要候選基因，對其進行多態性檢測與分型，并將基因多態性與刀鱭的生長性狀進行關聯分析，旨在篩選出能夠應用于長江刀鱭生長性狀遺傳改良的分子遺傳標記，為培育種質優良的刀鱭新品系提供理論基礎和依據。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗用刀鱭來自上海市水產研究所(上海市水產技術推廣站)奉賢科研基地。于2017年基于群體選育方法獲得繁育子代，同塘養殖2年后，隨機選取100尾刀鱭，用游標卡尺和電子天平測得其平均體長為(21.89±4.51)cm、平均體高為(3.40±0.74)cm、平均體質量為(39.83±22.73)g。剪取部分樣品尾鰭分別編號并置于裝有95%乙醇的2 mL離心管中，-20 ℃保存備用。

1.2 基因組DNA的提取

每個試驗樣品取25 mg左右，經滅菌ddH2O清洗后，剪碎置于1.5 mL離心管。參照天根生化科技(北京)有限公司的海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(DP324-03)的說明書，提取不同刀鱭樣品的基因組DNA。根據瓊脂糖凝膠電泳和NanoVue Plus紫外可見分光光度計的檢測結果評估樣本DNA的質量和濃度。取凝膠電泳檢測顯示條帶清晰、無拖尾降解現象、且OD260 nm與OD280 nm的比值在1.8～2.0的DNA樣品，將其稀釋到50 ng/μL后，保存于-20 ℃冰柜中備用。

1.3 PCR引物設計及多態性SNP位點的篩選

根據刀鱭MSTN基因的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計5對PCR引物(見表1)。其中Ce-MSTN-FL1和Ce-MSTN-FL2是參照大西洋鯡MSTN基因內含子和外顯子的相對位置設計而成，用于擴增刀鱭MSTN基因的第1內含子和第2內含子序列；Ce-MSTN-SC1、Ce-MSTN-SC2和Ce-MSTN-SC3則以刀鱭MSTN基因組DNA序列為基礎設計而成。然后，以具有極端生長表型的20尾刀鱭[即體質量最大的10尾魚(89.53±14.51 g)和最小的10尾魚(18.75±1.62 g)]的DNA樣本為模板，利用直接測序法篩選刀鱭MSTN基因組DNA上的多態性位點。

1.4 PCR擴增、測序和SNP分型

PCR擴增反應總體積為50 μL，包括2 μL的基因組DNA(50 ng/μL)、25 μL 2×Taq PCR MasterMix[1.25 UTaq聚合酶、500 μmol dNTP、20 mmol Tris-HCl(pH=8.3)、100 mmol KCl和3 mmol MgCl2]、2 μL的正引物(10 pmol/μL)、2 μL反向引物(10 pmol/μL)，最后用ddH2O補充總體積至50 μL。采用Eppendorf Mastercycler X50s PCR擴增儀進行擴增，PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，50～65 ℃(基于梯度PCR所獲得的引物最適退火溫度)退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，共40個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。20尾刀鱭樣品的測序結果利用BioEdit軟件進行序列比對，并結合測序峰值圖篩選潛在的SNP位點。基于SNP位點篩選結果，設計特異性的PCR擴增引物(見表1)，委托上海捷瑞生物工程有限公司利用SNaPshot基因分型技術對100尾2齡刀鱭進行SNP位點檢測和分型。

表1 刀鱭MSTN基因全長擴增及SNPs位點的篩選和檢測引物

1.5 SNP位點與性狀的相關性分析

利用GenAlEx 6.5軟件[15]計算刀鱭養殖群體的有效等位基因數(effective number of alleles，NE)、觀測雜合度(observed heterozygosity，HO)、期望雜合度(expected heterozygosity，HE)等遺傳參數，并對分析SNP位點進行哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)檢驗。利用PIC_CALC軟件計算試驗群體中每個SNP位點的多態信息含量(polymorphic information content，PIC)。利用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型(general linear model，GLM)分析每個SNP位點的不同基因型與刀鱭生長性狀(體質量、體高和體長)之間的關聯程度。差異顯著性水平設置為0.05。

2 結果

2.1 刀鱭MSTN基因擴增和SNP位點的篩選

刀鱭MSTN基因全長3 278 bp，由2個內含子和3個外顯子組成，其中第1、2內含子分別由578和454個堿基組成，均符合GT-AG原則；第1、2和3外顯子由456、368和1 422個堿基組成(見圖1)。經SNP位點篩選，僅在第1內含子上篩選到3個SNP位點(g.564G>T,g.755G>T 和 g.786C>T)，它們在刀鱭MSTN基因上的位置如圖1所示。基于突變位點測序峰值圖能夠有效進行等位基因的純雜合分型，在本研究中，峰值圖為單峰的均為對應基因型的純合子(G/G、T/T和C/C)，而峰值圖為套峰的則代表該位點為雜合子(G/T、G/T和C/T)(見圖2)。

2.2 不同SNP位點與生長性狀的關聯分析

刀鱭MSTN基因上的3個SNP位點共9種基因型分別與刀鱭的生長性狀(體質量、體長和體高)的關聯分析結果見表2。可以看出，位點g.564G>T的3種基因型個體的體質量、體長和體高的比較結果一致，均是GT>GG>TT，其中3種基因型個體的體質量和體長沒有顯著差異(P>0.05)，僅TT基因型個體的體高顯著小于GT型個體(P<0.05)。位點g.755G>T的3種基因型個體的體質量、體長和體高的比較結果一致，均是GT>TT>GG，其中3種基因型的個體的體質量和體長沒有顯著差異(P>0.05)，僅GG基因型個體的體高顯著小于GT型個體(P<0.05)。位點g.786C>T的3種基因型個體的體質量、體長和體高的比較結果一致，均是CC>CT>TT，其中CC型個體的體質量、體長和體高與CT型個體沒有顯著差異(P>0.05)，TT型個體的體質量、體長和體高與CC型和CT型個體的差異顯著(P<0.05)。

表2 刀鱭MSTN基因的3個SNP位點與生長性狀的相關性分析

2.3 SNP位點的群體遺傳分析

刀鱭MSTN基因上的3個SNP位點在刀鱭養殖群體中的遺傳多樣性參數見表3。有效等位基因數(NE)為1.497～1.835，觀測雜合度(HO)和期望雜合度(HE)分別為0.280～0.480和0.332～0.455，多態信息含量(PIC)為0.277～0.351，3個SNP位點均屬于中度多態(0.250.05)。

表3 刀鱭MSTN基因上3個SNP位點的遺傳參數分析

本研究所篩選到的3個SNP位點的基因型頻率和基因頻率見表4。從中可以看出，GT基因型在位點g.564G>T和g.755G>T中占據優勢地位，而CC基因型在位點g.786C>T中占據優勢地位；等位基因G、T和C分別為3個SNP位點的優勢基因。結合3個SNP位點不同基因型的生長數據可以看出，具有優勢基因型和基因的個體，其生長性狀亦優于其他基因型和基因的個體。

表4 3個SNP突變位點在刀鱭養殖群體中的基因型和等位基因頻率

3 討論

MSTN作為抑制動物成肌細胞活化、增殖和分化的強化效應因子，其基因在不同物種間高度保守，在某些條件下部分位點發生突變或缺失能夠導致抑制動物肌肉細胞生長的功能減弱，因其基因多態性往往與動物的生長、發育顯著相關，而在動物性狀遺傳改良方面具有重要的應用研究價值[16]。MTSN基因多態性與經濟性狀的關聯分析最初在牛、豬、雞等禽畜類動物中研究較多，證實該基因的部分突變位點與不同的經濟性狀存在顯著的相關性，能夠應用于相關動物的分子標記輔助良種選育研究[11]。

在水產動物的研究方面，近年來，部分學者已在黃顙魚(Pelteobagrusefulvidraco)[17]、大口黑鱸(M.salmoides)[12]、草魚(C.idella)[18]、吉富羅非魚[119]、金頭鯛(Sparusaurata)[20]及中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[11]等重要的水產經濟動物上開展MSTN基因多態性與生長性狀的相關性研究，以期能夠為相關水產動物良種的分子選育奠定理論參考與支持。本研究利用直接測序法在養殖刀鱭MSTN基因的第1內含子部分成功鑒定到了3個SNP位點(g.564G>T,g.755G>T 和 g.786C>T)，其中前兩個突變屬于顛換突變，位點g.564G>T中的GG、GT和TT基因型刀鱭個體分別與位點g.755G>T中的TT、GT和GG基因型個體相同，表明這兩個突變位點是連鎖的，且GT基因型個體的體高性狀分別顯著優于TT和GG型個體(P<0.05)。位點g.786C>T為轉換突變，其TT基因型刀鱭的體長、體高和體質量性狀均顯著低于其它兩種基因型(P<0.05)，CC基因型刀鱭的生長性狀亦優于CT基因型，表明T等位基因的突變對于養殖刀鱭的生長性狀具有不利影響。此外，本研究僅在養殖刀鱭MSTN基因的第1內含子部分檢測到突變位點，而在其他內含子和外顯子部分暫未檢測到突變位點，表明養殖刀鱭的MSTN基因序列相對保守，內含子由于不參與氨基酸的編碼，相對于外顯子，其受到的選擇壓力亦較小，因而更易于發生位點突變。

大部分學者亦在其他水產動物MSTN基因的內含子部分檢測到了與生長性狀顯著相關的SNP位點，與本研究的結果相一致。朱媛媛等[17]在黃顙魚(P.fulvidraco)MSTN基因的第1內含子上鑒定到1個能夠應用于雌性黃顙魚生長性狀改良的突變位點；俞菊華等[21]在建鯉(Cyprinuscarpiovar.jian)MSTN基因的第1內含子上篩選到1個與體型密切相關的SNP位點(T196G)；Wang Ying等[22]在紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)MSTN基因第2內含子上鑒定到1個與體質量、體長和體高性狀顯著相關的SNP突變位點(C1197T)，其CC基因型個體的體質量、體長和體高顯著低于另外兩種基因型的；唐永凱等[19]在吉富羅非魚MSTN基因第2內含子的728 bp處發現了1個與體型(體厚/體長、體高/體長)存在顯著相關(P< 0.05)的SNP突變位點(G/T)；張世勇等[23]在斑點叉尾魚回(Ictaluruspunctatus)MSTN基因的第2內含子上發現了1個與體質量和體長呈顯著性負相關的SNP位點(g.4355 G>C)，其GG基因型個體的體質量和體長顯著低于另外兩種基因型的。與這些研究結果不同的是，Sun等[24]在鯉魚(C.carpioL.)MSTN基因的第3外顯子上檢測到2個與體質量和肥滿度顯著相關的SNP位點。以上研究證實，不同的試驗對象，由于其所受到的選擇壓力及生存環境不同，因而產生了不同程度的遺傳突變，導致同一基因上的SNP位點具有一定的物種差異性。雖然不同水產動物MSTN基因突變位點的位置和特性有所差異，但是均與相應水產動物的生長性狀存在不同程度的相關性，這一發現有望應用于水產動物生長性狀的遺傳改良。

本研究利用直接測序法和SNaPshot基因分型技術，成功鑒定到了1個與養殖刀鱭的體長、體高和體質量性狀顯著相關的分子標記(g.786C>T)，該標記有望作為剔除劣質刀鱭繁育親本的候選分子標記。考慮到魚類的生長性狀受多種基因的調控，后續將繼續篩選更多與長江刀鱭生長性狀顯著相關的分子標記，用以制訂更加科學、有效的長江刀鱭分子標記輔助育種策略。