基于線粒體控制區D-loop序列的內蒙古大鰭鼓鰾鰍群體遺傳結構分析

楊艷平 楊麗文 烏蘭 繆麗梅 羅旭光

(1 內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特 010018；2 包頭黃河國家濕地公園管理處，內蒙古包頭 010010；3 內蒙古自治區水產技術推廣站，內蒙古呼和浩特 010018)

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是1種閉合、環狀的雙鏈 DNA 分子，具有進化速度快、分子量小、結構簡單穩定、便于研究等特點，是研究種群遺傳結構的理想材料[1-2]。線粒體控制區又稱D-環區(D-loop)，為非編碼區，是整個線粒體基因組變異最快和長度變異最大的區域[3]，具有進化速度快、遺傳變異大的特點[4]。近年來許多學者以測序技術為基礎，以D-loop作為分子標記對魚類遺傳結構進行了廣泛研究[5-8]，這對于魚類種群保護和管理具有重要的意義。

大鰭鼓鰾鰍[Hedinichthysyarkandensismacroptera(Herzenstein)]隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae)、條鰍亞科(Nemacheilinae)、鼓鰾鰍屬(Hedinichthys)，是1種較為古老的大型鰍科魚類，屬于內蒙古地區特有的魚類資源，在當地俗稱“大頭魚”。該魚為底棲魚類，通常在湖泊深處活動，主要以小型魚類、蝦、各類水蚤和水生昆蟲為食[9]，目前僅分布在我國第二大內陸河黑河的中下游水域，且較為集中地分布于內蒙古自治區阿拉善盟額濟納旗境內的居延海(蘇泊淖爾)。20世紀60年代，內蒙古境內黑河斷流造成居延海干涸，大鰭鼓鰾鰍在該地區幾近絕跡。2004年，隨著黑河改水工程的進行，居延海正式蓄水，大鰭鼓鰾鰍又在居延海出現，并有小規模的產量。大鰭鼓鰾鰍肉質細嫩，味道鮮美，具有生長較快、抗寒抗堿能力強、適應性強等優點，是內蒙古等西北地區高寒高鹽堿湖泊的理想養殖對象，對于高鹽堿水體資源開發具有重要的意義。目前已有大鰭鼓鰾鰍生物學特性及人工繁殖方面的報道[10-13]，但運用D-loop區序列分析大鰭鼓鰾鰍種群遺傳多樣性的研究鮮見報道。本研究運用線粒體D-loop區序列對采自內蒙古居延海及附近水域的52個大鰭鼓鰾鰍樣本進行了遺傳多樣性和遺傳分化分析，為開展內蒙古地區野生魚類遺傳資源調查、豐富該地區淡水魚類種質資源基礎數據提供支持，同時為保護大鰭鼓鰾鰍物種生態穩定性和遺傳多樣性，以及后續資源保護提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用大鰭鼓鰾鰍共52尾，采自內蒙古居延海及附近水域。對試驗魚進行形態學測量、稱量、編號，活體解剖后，取其肝臟等組織器官儲存于95%乙醇溶液中，并置于-20 ℃冰箱保存備用。

1.2 基因組DNA的提取和鑒定

將保存的標本取出，置于無菌蒸餾水中浸泡3 h以上。用組織勻漿儀將組織打碎，取勻漿后的組織約100 μg，采用Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒提取基因組DNA。用微量紫外分光光度計測量基因組DNA在260 nm和280 nm處的吸光度以及質量濃度。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量和純度。

1.3 引物設計

設計擴增D-loop區域的引物[14-15]，上游引物序列為DF1：5'-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3'；下游引物序列為DR2：5'-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3'。所有引物由生工生物(上海)工程有限公司合成。

1.4 PCR擴增和序列測定

序列擴增試劑使用Takara Premix PrimeSTAR HS。反應總體積50 μL：PCR Premix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，滅菌水22 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，共25個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下將擴增良好的條帶進行切膠回收，用天根DP209-03柱式膠回收試劑盒純化PCR產物。將純化后的PCR產物送至生工生物工程有限公司(上海)進行測序。

1.5 數據處理

對測定的DNA序列進行人工校正，采用DNAMAN 5.2.2軟件進行個體和魚類群體間的序列比對，分析序列的核苷酸堿基組成、位點變異；采用MEGA 5.1軟件進行系統進化樹、遺傳距離、GC含量等分析。利用DnaSP v5軟件分析基因多態性及單倍型，獲得群體序列遺傳多樣性參數，包括單倍型數(h)、單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π)。

2 結果和分析

對52個標本的D-loop區進行了序列測定，得到約947 bp的序列片段，電泳顯示擴增條帶單一，未發現非特異性條帶，試驗結果重復性較好，無外源 DNA 污染(見圖1)。

2.1 D-loop序列特征分析

2.1.1 堿基含量分析

在947 bp的D-loop序列中，堿基A、T、C、G的平均含量分別為34.5%、28.0%、21.3%、16.2%，其中G+C堿基平均含量(37.5%)明顯低于A+T堿基含量(62.5%)，具有明顯的堿基組成偏向性。具體結果見表1。

表1 大鰭鼓鰾鰍所測樣本的線粒體D-loop區的G+C含量

2.1.2 序列變異分析

在52個樣本中發現D5、D8、D9、D11、D12、D14、D17、D19、D21、D22、D23、D24、D25、D26、D32、D33、D34、D35、D36、D40、D41、D42、D43、D46、D49、D50、D51等27個樣本在645位點均缺失C堿基，突變總數為21；D-loop序列存在多態性位點/突變位點20個，單倍型數(h)為17，單倍型多樣性(Hd)為0.912，核苷酸多樣性(π)為0.0045。

2.2 遺傳多樣性和遺傳分化

2.2.1 系統進化分析

用MEGA 5.1軟件的Maximum Likelihood方法進行系統進化樹分析，樣本共分為2支，對應的樣本數分別為31和21個，說明大鰭鼓鰾鰍群體結構出現了一定的遺傳分化(見圖2)。

2.2.2 遺傳距離計算分析

遺傳距離計算結果顯示，52個樣本的D-loop區的平均遺傳距離小于0.010，說明個體間的親緣關系較近。

3 討論

作為內蒙古地區的特有魚類，大鰭鼓鰾鰍是該地區生物多樣性的重要組成部分[10]。同時，作為當地“賞胡楊林，品大頭魚”的旅游特色之一，大鰭鼓鰾鰍也是當地最重要的經濟魚類之一。因此，對大鰭鼓鰾鰍開展資源保護顯得尤為重要。

大鰭鼓鰾鰍D-loop區堿基組成為A(34.5%)、T(28.0%)、C(21.3%)、G(16.2%)，堿基呈現不均一的分布，其中G+C堿基的平均含量(37.5%)顯著低于A+T堿基的含量(62.5%)，具有明顯的堿基組成偏向性。這與其他魚類線粒體DNA的蛋白質編碼基因的特點一致[16-18]。

遺傳多樣性(genetic diversity)是生物多樣性的重要組成部分，與物種的適應能力、生存能力和進化潛力等密切相關[19-20]。掌握物種的遺傳多樣性水平可以為制訂針對性的保護和管理策略提供科學依據[21]。單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π)是進行遺傳多樣性研究的2個重要參數[22]。本研究針對內蒙古大鰭鼓鰾鰍線粒體D-loop區序列進行分析，分析其群體遺傳多樣性和遺傳結構，結果顯示，基于D-loop 區的大鰭鼓鰾鰍的單倍型數(h)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)分別為17、0.912和0.004 5，顯示出較高的遺傳多樣性。與大鰭鼓鰾鰍Cytb基因序列相比，基于 D-loop 區序列的種群突變位點數以及多態性位點的比例要高于Cytb基因[23]。這說明D-loop區序列與Cytb基因相比，發生突變的位點更多，突變機率更高，可能是因為魚類的線粒體 D-loop 區序列所受的選擇壓力較小、進化速率較快，而Cytb基因作為線粒體編碼基因，其進化速度相對較慢[14]。

Grant等[24]根據Hd和π，分別以0.5和0.005為界限，將魚類進化情景分為 4 種類型：低Hd和低π，高Hd和低π，低Hd和高π，低Hd和低π。整體來看，基于 D-loop 區序列的大鰭鼓鰾鰍的遺傳多樣性呈現出高Hd和低π的特征，其高Hd的特征接近于遺傳多樣性較豐富的長薄鰍(Hd=0.916)[25]、長江上游特有魚類紅唇薄鰍(Hd=0.967)[26]和高郵湖湖鱭(Hd=0.906)[27]等，而高于北江大刺鰍(Hd=0.541)[8]和異鰾鰍魚它(Hd=0.817)[28]；其低π的特征高于異鰾鰍魚它(π=0.002)，與長薄鰍(π=0.004 50)[25]相同，低于紅唇薄鰍(π=0.006 7)[26]、高郵湖湖鱭(π=0.006 27)[27]及北江大刺鰍(π=0.008 17)[8]等。由此可見，內蒙古地區大鰭鼓鰾鰍種群的mtDNA D-loop序列表現出較高的遺傳多樣性水平。有學者推測，類似的遺傳多樣性現狀可能是由1個較小的有效種群經歷“瓶頸效應”或“建群效應”后迅速增長而造成的，盡管變異導致了單倍型多態性的積累，但還未能導致其核苷酸序列多樣化的積累[29-30]。

20世紀60年代，黑河斷流造成西居延海干涸，至1992年，居延海也相繼干涸，使大鰭鼓鰾鰍在這一主要分布地區幾近絕跡。2002年，為保護西北地區生態環境和治理黑河流域，黑河改水工程開始實施。2004年居延海正式蓄水后，大鰭鼓鰾鰍又出現了，并有小規模的產量。但由于蓄水時間短，魚類資源還未能完全恢復和有效增加，大鰭鼓鰾鰍種群總體數量仍較小，尤其大型個體較少，與居延海干涸前的群體規模差距很大。人類的經濟活動和酷漁濫捕，以及不科學的養殖方式和繁殖技術等嚴重破壞了大鰭鼓鰾鰍種群的多樣性，嚴重威脅到該物種的生存。因此，應加強對大鰭鼓鰾鰍種質資源的評估，加大保護力度，進行合理的開發利用，以保持其遺傳多樣性，增大該資源恢復和提純復壯的機會。